【摘要】目的探讨吸烟与温石棉联合作用对体外培养细胞癌基因的影响。方法用Northern blot测定了烟溶液(CSS)与温石棉(CH)单独及联合作用后人胚肺(HEL)细胞c-fos和c-myc癌基因mRNA水平的表达。结果CSS和CH单独与HEL细胞作用24 h均可使c-fos mRNA水平升高，二者联合作用可协同增加c-fos mRNA表达的水平；CSS与CH单独与HEL细胞作用3次(每次24 h)后再传至第10代，均可使c-myc mRNA水平升高，二者联合作用也可协同增加c-myc mRNA的水平。结论CSS和CH可协同激活细胞某些癌基因的表达，这在二者联合致癌过程中可能起着重要作用。

The expression of oncogenes in HEL cells treated with cigarette smoking and asbestos

WANG Qi-En,FAN Jing-Guang,JIANG Kun

（Department of Occupational Health,Beijing Medical University,Beijing 100083,China.）

【Abstract】ObjectiveTo understand the combined effect of cigarette smoking and asbestos fibers on the expression of oncogenes in cultured cells; MethodsNorthern blot analysis was used to study the expression of c-myc and c-fos m RNA in human embryo lung(HEL)cells exposed to cigarette smoking solution(CSS) and chrysotile(CH)separately or simultaneously; ResultsThe level of c-fos mRNA increased when cells were exposed to CSS or CH for 24 hours separately,and the synergistic increase was found when cells were exposed to CSS and CH simultaneously.The increase of c-myc mRNA could also be found when cells were treated with CSS or CH for 3 times(24 hours each)and passaged to the 10th generation,and there was a synergistic increase when cells were treated with CSS and CH simultaneously. ConclusionCSS and CH may activate the expression of oncogenes synergistically,and the synergistic activation may play a key role in the combined carcinogenesis of cigarette smoking and chrysotile.

【Key words】Cigarette smoking; Chrysotile; Oncogenes

对于吸烟与温石棉(CH)单独的致癌机制研究，国内外都已做了大量的工作，但是二者联合致癌机制的研究却很少见。以前有关吸烟与石棉的联合作用研究，大多数人用B［a］P代替吸烟^［1］，已知香烟燃烧时产生的物质除B［a］P外还有许多种其他物质，仅以B［a］P代替吸烟不能完全说明吸烟的致癌机制。本研究将香烟燃烧后的烟雾通过HEPES缓冲液加以吸收，以此烟溶液(CSS)代替吸烟在体外进行实验可能更接近实际。虽然烟雾中有一些物质不溶于水，但至少比单独用B［a］P代替吸烟更能说明问题。癌基因的激活在肿瘤发生过程中起重要作用，为探讨CSS与CH单独及联合作用时是否能引起体外培养的人胚肺(HEL)细胞癌基因激活，本研究用Northern Blot检测了c-fos和c-myc癌基因mRNA的转录活性。

1材料与方法

1.1细胞培养HEL细胞由军事医学科学院赵修南同志惠赠。用质量浓度为0.125 %的胰蛋白酶+质量浓度为0.01 %的EDTA的消化传代，用含体积分数为10 %的小牛血清和双抗的MEM培养液于37 ℃，体积分数为5 %的CO₂的条件下培养，3天传代1次。

1.2CSS的制备^［2］将市售某卷烟厂生产的某牌号香烟(去掉过滤嘴)点燃，将其另一头接到连有大气采样器的大包试管上，管中盛有10 ml HEPES缓冲液(pH=7.35)，用0.5 L/min的流量抽吸，使烟气通过缓冲液，每次抽吸1支烟，以此CSS的浓度为0.1 支/ml，将CSS聚集后用气相色谱法测定表明，每10 ml CSS中含尼古丁(168.9±60.8)μg,用纸层析法测定表明多环芳烃含量低于0.5 μg，CSS的pH值为7.2。将此CSS稀释不同倍数后染毒。

1.3石棉的处理采用国产茫崖CH，用PBS配成不同浓度的混悬液，经超声分散和充分振荡混匀后备用，必要时高压灭菌。石棉纤维分散度为：＜5 μm占9 %，5～10 μm占46 %，10～20 μm占34 %，＞20 μm占11 %，直径＜0.2 μm占95 %，偶见较粗的纤维束。

1.4c-myc及c-fos癌基因表达变化的测定^［3，4］将细胞接种到培养瓶中，每瓶接种5×10⁵个，培养24 h后，分别加入0.625×10^-4 支/ml的CSS，2.5 μg/ml的CH，以及0.625×10^-4支/ml的CSS+2.5 μg/ml的CH，继续培养24 h，倒掉培养液，用D-Hank's液洗2次，提取细胞总RNA，用Northern blot分析c-fos癌基因的转录活性。将5×10⁴/ml的细胞接种于25 ml培养瓶中，每瓶2 ml，37 ℃，5 %CO₂培养24 h，用0.312 5、0.625×10^-4支/ml CSS和2.5、5.0μg/ml的CH染毒24 h，去掉上清液，用D-Hank's液洗3遍，传代后继续培养24 h，再用上述浓度的CSS和(或)CH染毒24 h，去毒后传代，继续培养24 h，再用上述浓度的CSS和(或)CH染毒24 h，去毒后传代，加入新鲜的MEM(含10%的小牛血清)继续培养。3 d传代1次，传至第10代时，提取细胞总RNA，用Northern blot 分析c-myc癌基因的转录活性。

2结果

2.1c-fos癌基因的表达用0.625×10^-4支/ml CSS和2.5 μg/ml CH单独及联合作用于HEL细胞24 h后提取细胞RNA，用c-fos癌基因探针进行Northern blot杂交，放射自显影后用自动图像分析仪分析积分光密度，结果表明，CSS和CH单独及联合作用均可使HEL细胞c-fos癌基因mRNA转录水平增高，其转录水平增高百分率分别为73.7 %、85.4 %、186.5 %(见图1、2)，提示CSS与CH可协同增加HEL细胞c-fos癌基因的表达。

2.2c-myc癌基因的表达用0.312 5、0.625×10^-4支/ml CSS和2.5、5.0 μg/ml CH单独及联合作用于HEL细胞3次后传至第10代，提取细胞总RNA，用c-myc癌基因探针进行Northern blot杂交，放射自显影后用自动图像分析仪分析积分光密度，结果表明CSS和CH均可使c-myc癌基因mRNA转录水平增高，0.312 5、0.625×10^-4支/ml CSS引起的c-myc癌基因mRNA转录水平增高率分别为60.5 %和70.2 %，2.5、5.0 μg/ml CH 引起的c-myc癌基因mRNA转录水平增高率分别为65.8 %和84.7 %，而0.312 5×10^-4支/ml CSS和2.5 μg/ml CH同时作用引起的c-myc癌基因mRNA转录水平增高百分率为168.4 %，提示二者可协同激活HEL细胞c-myc癌基因(图3，4)。

A：对照； B：0.625×10^-4支/ml CSS; C:2.5 μg/ml CH；

D：0.625×10^-4支/ml CSS+2.5 μg/ml CH

1CSS与CH单独及联合作用对HEL细胞c-fosmRNA水平的影响

0.625×10^-4支/ml CSS+2.5μg/ml CH

图2CSS与CH单独及联合作用对HEL细胞c-fos mRNA表达的影响

A：对照； B：0.3125×10^-4支/ml CSS; C:0.625×10^-4支/ml CSS;

D：2.5 μg/ml CH; E:5.0μg/ml CH;

F:0.3125×10^-4支/ml CSS+2.5 μg/ml CH

图3CSS与CH单独及联合作用对HEL细胞c-mycmRNA水平的影响

图4CSS与CH单独及联合作用对HEL细胞c-myc mRNA表达的影响

3讨论

c-myc癌基因产物是一类丝氨酸、苏氨酸磷酸化的细胞核内蛋白，具有与DNA结合的能力，通过促进或抑制有关基因的开放参与细胞生长分化的调控。在肿瘤发生过程中与癌细胞的表型改变、高克隆率、提高侵润性、高转移能力等方面关系密切^［5］。有资料表明，c-myc癌基因常常是促癌剂如TPA等物质的作用对象，所以可能在肿瘤的促生长方面起重要作用^［6］。现有的资料表明，只要c-myc癌基因过度表达，细胞便不能进入终末分化，而被强行地不断沿周期反复循环，这样也必然使细胞不能停留在细胞分化所要求的时相上^［7］。在本研究中我们首次用体外培养的HEL细胞作为研究对象，观察了CSS和CH单独及联合作用对HEL细胞c-myc癌基因mRNA表达水平的影响。结果表明，CSS与CH单独与HEL细胞反复使用3次后传至第10代的细胞中，c-myc癌基因mRNA水平明显升高，二者联合作用时对c-myc癌基因mRNA的高表达呈现加强作用；提示在CSS与CH单独及联合致癌过程中涉及c-myc癌基因转录活性的升高。国外有人用实验证明，c-ras和c-myc癌基因分别引入大鼠胚胎第2代成纤维细胞，均不能造成细胞的恶性转化，但将二者同时引入细胞时则可引起恶性转化，提示癌变是多种癌基因协同作用的结果^［8］。本研究结果还表明，CSS和CH都