【摘要】目的研究过氧化氢(H₂O₂)对体外培养的分化期大鼠胚胎神经细胞的氧化损伤以及硒的保护作用。方法MTT法检测细胞存活率，硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化岐化酶(SOD)活性，扫描电镜观察细胞膜完整性。结果H₂O₂抑制分化期神经细胞分裂增殖，经过氧化氢作用24 h的神经细胞，其胞液中SOD活力下降，MDA含量升高，并表现为浓度-效应关系；扫描电镜观察可见细胞膜损伤。细胞培养液中加入一定浓度硒可有效地减轻H₂O₂引起的神经细胞损伤。结论硒对H₂O₂引起的神经细胞氧化损伤可能有明显的保护作用。

The protective effects of selenium on oxidative damages of differentiating neuron exposed to H₂O₂

Kong Xing-feng,Chen Wan-rong,NIBing

（Biology Department of East China Normal University,Shanghai 200062,China.）

【Abstract】ObjectiveThe oxidative damages of rat differentiating embryo neuron exposed to H₂O₂ and the protective effects of selenium(Se) were studied in vitro. MethodsThe neuronal viability was detected using MTT stain.The concentrations of malondialdehyde (MDA) were determined by thiobarbiturif acid reactive substance method.The activity of superoxide dismutase (SOD) was determined by xianthine-xanthine oxidase method.The cell membrane was examined by scanning electron microscopy (SEM). ResultsH₂O₂ could inhibite the proliferation and survival of differentiating neuron.When the neuron exposed to H₂O₂ for 24h,the SOD activities declined,and MDA contents increased with a relation of dose-effect response.The degree of Lipid peroxidation corresponded with the results of membrane damage observed by SEM.Adding Se with given concentrations into cell culture could effectively reduce the neuron damages caused by H₂O₂.ConclusionSe could protect neurons against oxidative damages caused by H₂O₂.

【Key words】Hydrogen peroxide;embrgo Neuron culture; oxidative damage; Selenium;Rats

过氧化氢(H₂O₂)是一种较强的氧化剂，它产生的羟自由基(*OH)可引发脂质过氧化反应，并持续为链式反应，使自由基反应扩增放大，对细胞有明显的损伤作用^［1，2］。硒作为人体必需的微量元素和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的组成成分，具有明确的抗氧化，延缓衰老等功能，近年来受到广泛的重视和研究。是有效的抗氧化酶，能阻断或减轻脂自由基(LOO*)所致的脂质过氧化连锁反应^［3］。已有资料表明，低浓度硒可促进细胞增殖，高浓度硒可引起细胞毒性^［4］，但硒对神经细胞分化的作用尚未见报道。我们用大鼠胚胎中脑神经细胞微团培养技术，观察H₂O₂对分化期神经元细胞集落形成、脂质过氧化作用以及细胞膜结构的影响，并探讨硒对神经元氧化损伤的保护作用。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器F-12培养基为GIBCO公司产品；胰酶及MTT试剂(四甲基偶氮唑蓝)均为SERVA公司产品；神经元特异性烯醇化酶抗血清(1∶100)为DAKO公司产品；ABC免疫组化试剂盒和羊抗兔IgG为VECTOK公司产品；超氧化物岐化酶(SOD)，GSH-Px，丙二醛(MDA)试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品；其余试剂为国产分析纯试剂。

CO₂培养箱(NAPCO，美国)，倒置相差显微镜(HFX，NIKON)，酶标仪(MC-318型)，扫描电镜(JXA-840,JEOL)。

1.2细胞的培养、观察和鉴定

1.2.1神经细胞微团培养及集落形成率观察妊娠第13 d SD大鼠脱颈推处死，无菌条件下取大鼠胚胎中脑部分，胰酶消化制成密度为1×10⁶/ml的细胞悬液，按我们以前建立的方法进行微团培养^［5］。培养5 d后用体积分数为10 %的甲醛固定2 h，苏木精染液染色后在光镜下计数每一微团中集落数，以对照组集落数为100 %，计算各浓度组集落形成率。

1.2.2神经元鉴定细胞用体积分数为4 %的多聚甲醛固定12 h后，用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学的方法进行染色以鉴定神经元^［6］，兔抗NSE，羊抗兔IgG工作浓度均为1∶200，光镜观察NSE是否为阳性反应。

1.3MTT法检测细胞毒性将神经细胞接种于96孔板中(密度5×10⁵/ml，每孔200 μ1)，待细胞贴壁后，加入不同浓度的亚硒酸钠(Na₂SeO₃,终浓度为0.01、0.05、0.1、0、1、5、10 μmol/L)，作用24 h，再加入不同浓度的H₂O₂(终浓度为10、50、100、200、500 μmol/L)，继续培养24 h后，用MTT法检测活细胞数^［7］。根据所测OD值计算细胞存活率(细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值×100 %)。

1.4SOD与MDA的测定将密度为4×10⁵/ml细胞接种于24孔板，每孔1 ml。加入不同浓度的H₂O₂(终浓度同上)，作用24 h后继续培养3 d，胰酶消化，收集不同浓度组细胞，光镜下计数。细胞悬液反复冻融3次，10 000 r/min离心取上清液。用Lowrys法测定蛋白浓度，用黄嘌呤氧化酶法测SOD活力，用硫代巴比妥法测定MDA含量^［8］。

1.5扫描电镜观察按前述微团培养法将神经细胞接种于24孔板玻片上(各孔事先放入经多聚赖氨酸处理的5×5 mm²的洁净无菌玻片)中，经不同浓度的Na₂SeO₃和H₂O₂(浓度同上)作用后依次用体积分数为2.5 %的戊二醛磷酸缓冲液和体积分数为10 %的锇酸固定，按常规乙醇梯度脱水，HMDS干燥，离子溅射喷金，扫描电镜观察并摄片。

2结果

2.1正常分化期神经细胞形态观察大鼠胚胎神经细胞正常培养5 d 后细胞生长分化完全，形成明显的细胞集落，集落间神经突起丰富，并连结成网络状。NES染色呈现特异性的红棕色。

2.2H₂O₂对神经细胞的损伤

2.2.1H₂O₂对神经细胞存活和分化的影响不同浓度H₂O₂使神经细胞生长受到不同程度抑制，并呈剂量依赖关系，浓度大于200 μmol/L表现明显的细胞毒性。其半数生长抑制浓度IC₅₀为120 μmol/L(图1)。

图1MTT法测得不同浓度H₂O₂对神经细胞生长的影响

在无明显细胞毒的情况下(细胞存活率大于80 %)，用集落形成率的减少作为细胞分化抑制程度的终点^［5］，结果显示，在H₂O₂作用下，集落形成率有不同程度下降，并呈剂量-效应关系。

2.2.2SOD和MDA的变化经不同浓度H₂O₂作用24 h后的神经细胞，细胞内SOD活力下降(图2)，脂质过氧化产物MDA的含量升高(图3)；H₂O₂浓度大于100 μmol/L时，与对照组比较，差异有显著性。

图2不同浓度H₂O₂作用下的神经细胞SOD的变化

图3不同浓度H₂O₂作用下的神经细胞MDA的变化

2.2.3H₂O₂对细胞损伤的扫描电镜观察正常神经细胞经微团培养，集落密集，突起丰富，胞体匀称，细胞膜光滑、平整(图4 a、b)。经不同浓度H₂O₂作用后，细胞膜受到不同程度损伤。50 μmol/L H₂O₂作用，集落数及神经突起减少不明显，可见到部分细胞膜受到破坏，只有极少数细胞膜破损较严重；经100 μmol/L H₂O₂作用24 h后，集落数目减少，突起减少，胞体肿胀，折光率下降，细胞膜受损较严重，部分细胞膜穿孔破裂，有些仅剩细胞骨架(图4，c、d)。

a、c、e为放大50倍的扫描电镜图像，显示神经细胞集落整体观；b、d、f分别为各自的局部放大像，显示单个细胞的形态。a、b为正常培养的神经细胞，集落密集，突起丰富，胞体匀称，细胞膜完整；c、d为100 μmol/L H₂O₂作用24