内容提要应用一将突变靶基因与哺乳细胞基因组DNA相分离的实验体系，证明化学诱变剂诱发的基因突变可发生在损伤碱基以外的正常序列中(非定标性突变)，并有突变谱特征和突变好发的序列特异性。它的发生依存于化学诱变剂诱发的基因表达改变，应用mRNA差异显示和反义技术分离到两个基因表达序列标识，其相关基因表达被阻断后可分别促进和抑制化学诱变剂诱发的非定标性突变。用体外DNA复制技术证明其发生基础是由于化学诱变剂引发细胞DNA复制保真度的下降，而细胞错配修复功能未发现异常，但DNA聚合酶酶谱发生改变。还证明它的发生可因细胞应激信号通路激活剂所促进，在化学诱变剂作用后有蛋白磷酸化谱和蛋白酪氨酸残基磷酸化谱的改变以及应激激活蛋白激酶的激活和cAMP浓度升高。细胞信号转导通路的激活参与了非定标性突变的发生。

根据哺乳细胞诱发突变特别是紫外线诱发突变的研究形成了有关突变形成机制的传统概念：即大部分诱发的突变是基于在DNA半保留复制时面对DNA损伤发生的误插(misinsertion)；还认为在大肠杆菌中起作用的诱导机制在此并没有重要作用。由于在啮齿类细胞关于hprt基因座位突变的研究中发现突变频率最高的为G*C→A*T碱基转换(transition)，因此认为这是由于在跨损伤合成中起作用的DNA聚合酶引起的插入偏离所致^［1］。应用一个将突变靶基因与哺乳细胞基因组DNA相分离的实验体系证明化学诱变剂诱发的基因突变可发生在损伤碱基以外的正常序列中，并对其发生机制作了较系统的研究，获得了一些新的分子事件。

1化学诱变剂诱发哺乳细胞的非定标性突变

张小山等^［2］应用一携带SupF tRNA基因的穿梭质粒pZ189，转染在24 h前经受半寿期仅1.1 h的烷化剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝胍(MNNG)攻击的vero细胞，从细胞中回收到的在细胞体内进行过复制的质粒中选出了靶基因SupF tRNA的突变体。在0.2和2 μmol/L MNNG预处理细胞中其点突变频率分别比自发的高5.8和2.9倍(p＜0.01)；由此证明烷化剂MNNG攻击后可在非损伤碱基部位诱发突变。这种突变对应于发生在损伤碱基部位的突变称为非定标性突变(nontargeted mutation)。对这些突变体SupF tRNA基因的序列分析证明，89%的碱基置换发生在G·C碱基对上；59%碱基置换为碱基颠换(transversion)，其余的为碱基转换；而且碱基置换的形式主要为G·C→T·A和G·C→A·T，这与直接攻击质粒DNA的不同。而且还发现突变发生有序列特异性，因为48%的碱基置换发生在SupF tRNA基因的6个部位上，它们中的4个具有5’-TTNN序列，其中N为G或C，突变就发生在N碱基。发生在SupF tRNA基因61、70、99和103碱基部位的T→C、G→T、G→T和G→C的置换，是MNNG直接攻击质粒DNA而形成的突变体中从未报告过的碱基置换形式。发现的5个移码突变有2个发生在SupF tRNA基因的99-105碱基区域的GGTGGGG序列上，因此非定标性移码突变可能也有好发的热点序列。

2哺乳细胞非定标性突变形成的基因表达依存性

孙雪敏等^［3］用实验证明MNNG诱发的非定标性突变依存于MNNG处理后的基因表达改变。分析细胞在MMNG攻击后不同时间转染质粒pZ189，在SupF tRNA基因中发生的非定标性突变的发生频率发现经0.2μmol/L MNNG处理2.5h后,3、6、12、24、36 h 转染pZ189，靶基因中的诱发和自发点突变频率的比分别为1.11、4.39(P＜0.01)、4.09(P＜0.01)、1.46和1.83，即非定标性突变在3 h时开始显现，随后逐渐升高，于12 h达最高峰，以后又逐渐回落。这种时相特征符合这种突变形成的分子机制中有由MNNG处理诱发的一些基因表达改变所生成的基因产物的参与；更为直接的证据来自细胞在MNNG攻击后用RNA合成抑制剂0.5 μg/mL放线菌素-D阻断基因转录，非定标性突变形成被完全抑制。诱发突变频率(×10^-4)自8.24降至2.28(P＜0.01)，后者与自发突变频率2.54无显著差异(P＞0.05)。

3参与非定标性突变形成的基因的分离

用mRNA差异显示技术和反义核酸技术，胡文蔚等分离了在MNNG处理后发生表达改变的基因表达序列标识(expression sequence tag,EST)，并鉴定了2个参与细胞非定标性突变形成有关的cDNA片段。mRNA差异显示(mRNA differential display,DD-PCR)技术是寻找真核细胞表达改变的基因的一个较为简便的方法。首先将各组细胞的RNA经逆转录生成相应的cDNA，然后通过由T₁₁MN(M为A、C或G，N为A、T、C或G)的3’端锚定引物(anchored primer)和5’端的任意引物(arbitrary primer)的随机组合对所得cDNA进行PCR扩增，用测序聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，可分离有表达差异的基因的EST。回收的EST可进行重组和进行序列分析研究。胡文蔚等^［4］通过26对锚定引物和任意引物组合从MNNG攻击过的细胞中分离到32个有表达差异的EST。对比这些EST的显示是否受蛋白合成抑制剂的影响，即它们的表达改变是否依存于另一个基因的基因表达产物，把这些EST所代表的基因区分为初级和次级反应基因。在分离别的32个EST中属于初级反应基因的有14个、次级反应基因的有8个，另10个EST其表达改变仅见于MNNG与蛋白合成阻断剂联合处理时。为了分析这些EST所代表的基因与非定标性突变发生的关系，通过改建商品化的真核细胞表达载体使之适合于与用于SupF tRNA基因非定标性突变检测的穿梭质粒pZ189配套使用和由此构建含反向插入EST的真核细胞表达重组体，获得了一些细胞系它们的相应基因被表达的反义RNA所阻断。通过对这些细胞的MNNG诱发的非定标性突变发生率的观察，筛选到两个EST片段(片段9和10)，它们的相应基因的表达被阻断后可显著影响非定标性突变的发生。片段9的相关基因表达被阻断后MNNG诱发的非定标性突变频率(×10^-4)自25.0增高至67.0(P＜0.05)，而相应的自发突变频率分别为4.7和4.0(与相应的诱发突变频率相比P＜0.01）^［5］；片段10的相关基因表达被阻断后MNNG诱发的非定标性突变频率(×10^-4)自16.1降至2.5(P＜0.01)，而相应的自发突变频率分别为4.6和5.0(前者与相应的诱发突变频率相比P＜0.05，后者P＞0.05）。经检索，在Genbank数据库中未找到与这两个EST片段有高同源性的cDNA或EST序列。进一步深入研究这些基因的全貌及其产物作用的分子机制对于最终阐明突变的分子机制是有价值的。

4哺乳细胞非定标性突变是DNA复制保真度下降所引起的细胞遗传不稳定的一种表现

细胞非定标性突变发生的时相分析所显示的延迟发生特点和基因表达依存性所显示的后生性机制(epigenetic mechanism)，提示它实际上是化学诱变剂诱发细胞遗传不稳定的一种表现。为了探索以非定标性突变为特征的细胞遗传不稳定的发生机制，冯朝晖等^［6］用体外DNA复制系统证明在MMNG攻击过的细胞抽提液中进行复制的产物，其复制差错明显高于在对照细胞抽提液中进行的。将pZ189 DNA的体外复制产物转染特定的宿主菌后证明在0.2 μmol/L MNNG处理后6、12、24小时的细胞抽提液中进行复制所获得的pZ189中，靶基因SupF tRNA基因的突变频率(×10^-4)分别为12.7、15.7和10.3，而在对照细胞抽提液中复制的为1.8(P＜0.01～0.05)；由于体外DNA复制系统中由外部添加充足供应量的前体物质(dNTP)和能量(由磷酸肌酸提供)，而DNA复制过程中所需的酶和其余蛋白则来自细胞抽提液，因此DNA复制保真度的降低应归咎于细胞抽提液中某些蛋白成分的改变。已知细胞DNA复制的高保真度主要由参与复制的DNA聚合酶的校读功能和在复制后进行错配修复的酶系维持。用合成的有G*T碱基错配的寡核苷酸双链进行凝胶阻滞试验和特别设计的酶切位点的改变来检查细胞抽提液中G*T错配结合蛋白和对G*T错配的修复能力，在不同浓度MNNG处理的细胞中，在不同时间内都未发现异常^［7］。但是用定量RT-PCR证明细胞经MNNG攻击后无校读功能的DNA聚合酶β表达明显升高，DNA聚合酶β的RT-PCR产物的光密度值与内参照β2-微球蛋白的光密度值的比在MNNG处理后的12、24、30 h分别为0.975±0.092、1.013±0.081和0.964±0.116,显著高于对照的0.485±0.086(P＜0.05)，其他时间段则与对照无显著差异；DNA聚合酶α、δ、ε和拓扑异构酶Ⅱα未发现表达改变^［8］。

5细胞信号转导通路与非定标性突变形成

孙雪敏等^［3］发现可激活应激信号转导通路的蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHM)5 μg/mL不仅不抑制MNNG诱发的非定标性突变反而可促进其发生。0.2 μg/L MNNG诱发的非定标性突变的突变频率(×10^-4)自对照的6.38增高至12.27(P＜0.05)；这提示作者设想非定标性突变的发生有细胞信号转导通路的介入，因为CHM可延长MAPK(丝裂原激活的蛋白激酶)系统中ERK_S(细胞外信号调节激酶)和JNK/SAPK(c-Jun氨基末端激酶/应激激活的蛋白激酶)的激活时间。在磷饥饿后在含³²P标记磷酸盐预标记的培养细胞的抽提液用双向蛋白电泳发现在MNNG或CHM处理后都出现两个分子量分别为68和43 kDa左右的磷酸化蛋白斑^［9］；鲁靖等用抗磷酸酪氨酸抗体的Western印迹试验也证明，MNNG和CHM处理细胞中有62和45 kDa蛋白质发生酪氨酸残基磷酸化程度增强；用抗Jun-N-末端激酶(JNK/SAPK)抗体的Western印迹试验证明JNK磷酸化增强，用固相酶活性测定证明JNK的活性于0.2 μg/L MNNG处理后升高了6.7倍。最近还证明细胞经0.2 μg/L MNNG处理后早期就有cAMP浓度升高反应，提示有cAMP-PKA通路的激活。

6结语

根据以上研究结果，对诱变剂诱发的以基因非定标性突变为特征的遗传不稳定的发生机制，提出以下假设：