KEY WORDSDifferential display;Shuttle plasmid;Transgene animal;Fluorescence in situ hybridization;Flow cytometry;

近20年来，毒理学领域发生前所未有的巨大进展，而这些进展的取得，在很大程度上得益于科学新思想的渗透和新技术的应用。特别是细胞生物学和分子生物学理论和技术的飞速发展，赋予毒理学工作者新的启迪和工具，从而改变了毒理学研究的基本格局，真正实现了从整体和器官水平向细胞和分子水平的飞跃。1993年3月，美国著名的科学专栏评论家Marshall在“Science”杂志上以显要的位置发表了题为“毒理学进入分子水平”(Toxicology goes molecular)的专论，指出“一批新的毒理学家正在应用超敏感的探针检测细胞水平的毒效应，并制订出预防接触这些毒物的措施”(A new bread of toxicologists is using ultrasensitive probes to discern toxic effects at the cellular level and working on preventive measures for those exposed)。中国毒理学会理事长吴德昌院士在中国毒理学会第二届学术会议(1997，5，西安)所作的“迎接21世纪的中国毒理学”报告中强调，随着医学科学的发展，毒理学也已经和正在发生着巨大的进展和变化，其中最重要的变化是“分子生物学理论和技术的引入，由于癌基因、抑癌基因、外源物受体删除模型及其他相关领域的重大发现与进展，使得人们对外源物致癌机理及生物学的理解有很大的提高，在研究方法中基因引入技术令人瞩目，可以此来深入研究DNA所引起的毒理学作用”。纵观我国毒理学的发展历程，一些常用的细胞与分子生物学技术，如：基因重组和克隆技术、核酸杂交技术、PCR技术、DNA测序技术以及一系列突变检测技术已广泛应用于外来化学物和环境致癌物引起的DNA损害、基因突变、加合物形成、基因多态、癌基因和抑癌基因的检测，数量逐年增加。特别是近年来，一些新的细胞与分子生物学技术的引进与建立，大大提高了毒理学研究的整体水平。现着重对我国近年来新开展的几项细胞与分子生物学技术的原理及其在毒理学领域的应用进行评述。

1差异显示技术

分子生物学的许多技术如Southern和Northern印迹技术、PCR技术和原位杂交技术等，都赖以应用特定的探针或引物才可测知基因的改变和表达的情况，而某一基因的探针或引物常须在该基因已被克隆和了解之后才能获得。由于各种化学毒物和环境危害因素引起的基因改变或新基因的出现大多是未知的。未知新基因的探查、分离和克隆是一项非常重要和具有创造性的工作，常用方法有差减杂交法(Subtraction hybridization)，差异显示法(Differential display)和染色体步移法(Cromosome walking)。这些方法各有其优缺点，要求条件难易程度不同。在我国现有实验条件下，不少单位已可开展前两种技术。差减杂交法可有效地富集未知目的基因的表达片段，但它是一项十分耗时费力的工作，而且存在着诸如需要大量的RNA为出发材料，实验步骤繁琐以及难以检测低丰度的mRNA等缺点，因此难以推广。1992年Liang Peng与Pardee在差减杂交基础上建立的差异显示技术，以RNA用量少、操作简便快捷和灵敏度高、重复性好等优点，使以上问题的解决有了突破性进展，随即被广泛应用。

差异显示技术是在转录水平上研究基因表达差异的有效方法。它通过一系列的锚定引物与随机引物组合把不同种细胞(如正常和转化细胞)的mRNA进行分组反转录，用PCR方法扩增cDNA，用序列凝胶电泳法显示出扩增结果，比较正常的和异常的cDNA带，从而找出差异表达的基因。差异显示技术建立至今仅6年时间，便在分析基因表达差异、绘制遗传图谱、分离特异性表达基因、临床遗传疾病的诊断等方面得到广泛的应用，并不断得到改正和完善。我国学者在最近开始将这一技术应用于毒理学和环境医学领域，取得了一定进展。军事医学科学院李刚、吴德昌等^［1］利用mRNA差异显示技术比较了原代大鼠气管上皮细胞(RTE)与α-粒子诱发的恶性转化RTE细胞之间基因表达的差异状况，共观察到近80个差异表达基因片段，排除假阳性片段后，对15个差异表达基因片段进行了克隆、测序。共向Gene Bank登录7条新基因序列，为探讨α-粒子辐射致癌机理和危险度评估提供了重要资料；北京医科大学鲁民风、刘霜等^［2］对黑色氧化镍(Ni-2O-3)染毒后形态转化的人胚肺细胞用mRNA差异显示技术进行测序和同源性分析，表明差异片段与Cyclophilin(一种与程序性细胞死亡时大片段DNA断裂有关的基因)mRNA的329-795碱基序列同源；浙江医科大学胡文蔚等^［3］也应用这一技术观察了烷化剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)处理的猴肾Vero细胞的差异表达情况，发现MNNG单独或合并环已亚胺(CHM)处理可诱导参与信号传导的基因表达发生改变而影响信息传递。预防医学科学院刘秉慈目前正在进行着“粉尘诱导的肺纤维化及癌变的基因差异显示研究”的国家自然科学基金课题，这将为阐明粉尘诱癌机理和我国差异显示技术的发展起推进作用。

2单细胞凝胶电泳

单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis SCGE)又称彗星试验(Comet assay)，是近年来广泛开展的一项新的有核细胞DNA损害的检测方法。1984年首先由Ostling和Johanson建立，最初是在中性电泳条件下检测DNA双链断，随后Sigh等(1988年)对实验条件进行了改良，利用碱性条件溶解分散于琼脂糖凝胶中的细胞然后进行电泳，使DNA双螺旋变性解链后释放出断裂的碎片在电场中向阳极泳动，形成头向阳极尾向阴极的彗星样影像，大大提高了检测DNA损害的敏感性，从而使该方法展示出强大生命力。由于该方法具有敏感，简便，快速、低耗，重复性好等独特优点，并可直接观察单个细胞内的DNA损害，因而迅速成为近年最流行的DNA损害检测方法而应用于遗传毒理学、辐射生物学、肿瘤学、老年学、病理学、环境生态学以及环境与职业人群的生物监测。迄今全世界共约300余篇论文发表，内容涉及各种物理(UV、X射线、γ辐射等)，化学因素(环境污染物、致癌物、化学药物、职业中毒等)和生物学因素共50种；所研究的细胞类型30余种。国内从1995年开始有文献报告，迄今已发表近40余篇文献。

笔者所在实验室近3年来陆续利用单细胞电泳技术观察了镍、铬、镉、石棉、三氯乙烯、苯、甲基叔丁醚、甲醛、H₂O₂对人外周血淋巴细胞和人胚肺成纤维细胞DNA损害，并对石棉、三氯乙烯和苯作业工人进行监测^［4～13］。最近，又在此基础上建立了检测DNA交联和DNA蛋白交联的方法^{［6，12，13］}，该方法的原理是基于DNA与DNA分子或DNA与蛋白质分子的交互联结，在电泳过程中必将阻止DNA的泳动。通过使用标准化的随机分布的DNA断裂剂如甲基甲磺酸(MMS)、X-射线或γ-射线处理的细胞使之产生特异的DNA链断裂，则可产生标准化的特定长度的彗星影像，在交联剂存在时，由这些标准断裂剂形成的彗星长度将大大缩短。为了进一步确定DNA-蛋白质交联的形成，还可以加入高浓度的蛋白酶K到凝胶上以去除与DNA交联着的蛋白质。通过与不加蛋白酶K的凝胶比较，从而确定这种交联对DNA迁移率的影响。我们实验室最近已利用改良的单细胞凝胶电泳技术观察了甲醛、镉、镍和顺铂引起的人外周血淋巴细胞DNA交联和DNA-蛋白质交联，并与碱洗脱方法进行比较，证实了这种方法是检测交联剂对DNA损害作用的有效方法，并进一步开展了整体动物和人群的研究，使单细胞凝胶电泳成为可检测多类型DNA损害的有效方法。同济医科大学劳动卫生教研室^{［14，15，16］}和环境卫生教研室^{［17，18］}分别开展了高温、CO和粉尘联合作用和硒、苯引起DNA损伤的检测；北京医科大学劳动卫生教研室^{［19，20］}观察了吸烟与温石棉联合作用对人胚肺细胞和人造矿物纤维对A549细胞DNA的断裂效应。华西医科大学衡正昌、张遵真等^［21］开展了二氯胺基酚对V79细胞DNA损伤效应的研究。山西大学、西安医科大学和上海医科大学等单位也陆续在毒理学领域引进单细胞凝胶电泳技术。

3穿梭质粒在突变检测中的应用

穿梭质粒是一类既可在哺乳动物细胞中复制，又可在细菌细胞内增殖的特殊的复合型质粒，由病毒基因组的部分序列(启动子、增强子、复制与转录起点等)，质粒的部分序列(复制起始点及抗性基因等)、靶基因和选择基因构建而成。近几年来，以SV40病毒为基础，以大肠杆菌tRNA琥珀突变抑制基因SupF为突变靶基因的短暂复制型穿梭质粒已广泛应用各种诱变剂在哺乳动物细胞内的突变研究，其中最有代表性的是美国学者Seidman构建的PZ189质粒。将诱变剂处理的穿梭质粒转染哺乳动物细胞，或先转染后再用诱变剂处理，经复制形成突变后，从细胞提取质粒，转化宿主菌，在X-Gal和IPTG琼脂平板上筛选突变子，正常菌落为蓝色，若靶基因SupF由于诱变制作用而失活，则呈白色，并可进一步对靶基因直接测序以了解突变的位点、类型、序列特异性等信息。最近作者又进一步对该质粒进行了改进，在靶基因下游紧邻处加一个8bp的标识序列(Signature Sequence)，构建了PSP189质粒。诱变剂处理后，同时测定靶基因和标识序列，根据标识序列的改变情况可判断并区分独立突变或同胞突变，能更精确地在DNA分子水平上评价突变的性质和热点。由于穿梭质粒能够在细胞与哺乳动物细胞中间“穿梭”，靶基因的突变又是在哺乳动物细胞内发生，因而能够较真实反映高等哺乳动物的突变机理。同时SupF靶基因的突变很容易在细菌中通过显色反应筛选突变子并进行序列分析，使表型改变在DNA分子水平上得到证明，且其任何一位置发生单碱基置换都能从表型改变检测出来，敏感性极高。利用穿梭质粒研究基因突变始于80年代，迄今全世界已有数百篇文献报告，包括了放射线、重金属、环境诱变剂和致癌物引起的基因突变。我国最近开始