摘要：目的：确定P75(神经生长因子低亲合力受体)在坐骨神经损伤后周围神经系统的表达分布。方法：切断大鼠右侧坐骨神经再吻合，术后不同时段上，切取与之相连的L₄～L₆脊髓节段和两侧脊神经节、左侧坐骨神经、吻合的右侧坐骨神经段作冰冻切片，再行LSAB免疫组化染色，光镜下观察、拍照。结果：P75在右侧脊髓前角运动神经元胞体、脊神经节感觉神经元胞体和右侧坐骨神经呈免疫组化阳性反应，而左侧均呈阴性反应。结论：P75在坐骨神经损伤一侧的脊髓前角运动神经元胞体、脊神经节感觉神经元胞体和坐骨神经均有表达，而在未损伤的周围神经系统无表达。

The expression of P75 following peripheral nerve injury in rat

Yin FangmingQin jianqiangJiang Lixin, et al.

(Department of Anatomy, The First Military Medical University, Guangzhou 510515)

Abstract：Objective:To determine the expression site of P75 following peripheral nerve injury in rat.Methods:The right sciatic nerve of SD rat was cut and then anastomosed. At different intervals of postoperation, incisional biopsy was carried out from the spinal cord (L₄～L₆)，collateral spinal ganglion, the left and right sciatic nerves, and stained with LSAB i mmunohistochemical method.Results:Positive immunoreactions happened in the operated sciatic nerve (right),the ipsilateral spinal ganglion and motor neuronal body of spinal cord.Conclusion: P75 expressed only in the injured sciatic nerve,the ipsilateral spinal ganglion and motor neuronal body of spinal cord, not in the normal peripheral nerve system.

Key sords：Peripheral nerve injuryP75Receptor expression▲

神经生长因子(Nerve Growth Factor, NGF)被认为有促进周围神经损伤修复的功能，但其作用机理目前仍不清楚。目前的研究认为，NGF通过两种受体起作用：神经生长因子低亲合力受体(Low-affinotu Nerve Growth Factor Receptor, LNGFR, P75)和神经生长因子高亲合力受体(Tyrosine kinase A, Trk A)^［1］。Trk A被认为是NGF的功能性受体，传导NGF的信号；而P75的功能仍不清楚，因此，研究其损伤周围神经的再表达将有助于研究NGF的作用机理及P75的功能。

1材料和方法

1.1实验动物及分组选用Sprague Dauley(SD)大鼠60只、体重230～250g(第一军医大学动物中心提供)，雌雄不限，随机分成12组，每组5只。

1.2动物模型制作用1%戊巴比妥纳(40mg/kg)腹腔麻醉后手术，显露右侧坐骨神经，距梨状肌下孔0.5 cm处切取0.8 cm神经段，然后再原位缝合(在手术显微镜下，用10-0显微缝合线作神经外膜缝接)。整个过程在无菌条件下进行。

1.3取材与切片分别于术后1、4、7、14、21、30、45、60、90、120、150、180d取材。经左心室向升主动脉插管，先灌入洗涤液(生理盐水200ml，肝素钠8mg，盐酸普鲁卡1.0g)，再灌进固定液300ml(0.1mol/L PB、4%多聚甲醛、1%戊二醛)。暴露两侧坐骨神经，沿坐骨神经取出椎管内与之相连的L₄～L₆两侧脊神经节、L₄～L₆段脊髓、右侧吻合的中间神经段和左侧相应位置的0.8 cm坐骨神经，在固定液中外固定2h。经过0.1mol/L PB缓冲液清洗后，置于20%蔗糖0.1mol/L PB缓冲夜中浸泡过夜。在冰冻切片机上，将两侧坐骨神经段和L₄～L₆段脊髓作横向切片； 脊神经节首先在解剖显微镜下剥去外膜， 沿长轴方向切片，所有切片厚度均为30μm。

1.4LSABN免疫组化染色

①把两侧坐骨神经段、L₄～L₆段脊髓和两侧脊神经节的冰冻切片置于24板内，用0.01mol/L PBS漂洗。

②0.3%H₂O₂甲醇阻断内源性过氧化物酶，室温20 min。

③0.01mol/L PBS漂洗 5min×3次。

④正常羊血清(1∶20)封闭非特异性结合位点，20min后去除但不漂洗 。

⑤小鼠抗大鼠P75单克隆抗体(1∶30， Boehringer Mannheim公司)4℃孵育24h。

⑥0.01mol/L PBS漂洗 5mn×3次。

⑦生物素标记羊抗鼠二抗(1∶500，K9002 羊抗鼠LSAB试剂盒，DAKO公司) 37℃，30min。

⑧0.01mol/L PBS漂洗 5min×3次。

⑨链菌素亲生物蛋白-过氧化物酶复合物(Stretavidin reagent), (1∶500 ，K9002羊抗鼠LSAB 试剂盒，DAKO公司)37℃，30min。

⑩ 0.01mol/L PBS漂洗 5min×3次。

B11DAB/H₂O₂(0.05%/0.001%)呈色，室温下8min

B120.01mol/L PBS漂洗5 min×3次。

B13 捞片，贴于载玻片上。

B14常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

B15光镜观察。

2结果

2.1P75在神经段染色结果

右侧神经段，镜下可见神经组织呈黄褐色，因而，免疫组化反应呈阳性(见图1)；左侧神经段，镜下未见神经组织呈黄褐色，因而，免疫组化反应呈阴性。

图1右侧坐骨神经损伤后14d，P75在右侧神经段免疫组化反应呈阳性 ×200

2.2P75在脊神经节染色结果

右侧脊神经节感觉神经元胞体，镜下可见呈黄褐色，因而，免疫组化反应呈阳性(见图2)；左侧脊神经节感觉神经元胞体，镜下未见呈黄褐色，因而，免疫组化反应呈阴性。

图2右侧坐骨神经损伤后7d，P75在右侧脊神经节感觉神经元胞体免疫组化反应呈阳性 ×2002.3P75在脊髓染色结果

右侧脊髓前角运动神经元胞体，镜下可呈黄褐色，因而，免疫组化反应呈阳性(见图3)；左侧脊髓前角运动神经元胞体，镜下未见呈黄褐色，因而，免疫组化反应阴性。

图3右侧坐骨神经损伤后7d，P75在右侧脊髓前角运动神经元胞体免疫组化反应呈阳性 ×200

3讨论

1979年Sutter^［1］第一次揭示有两种神经生长因子受体(NGFR)，即神经生长因子低亲合力受体P75和神经生长因子高亲合力受体Trk A。以后这一理论进一步被证实^［2］。TrkA是神经生长因子的功能性受体，传递信号，促进神经再生，已被人们所确认^［3，4］，但P75的功能目前仍然不清楚，Rabizadeh等研究认为P75能诱导神经细胞死亡^［5］，因此，研究周围神经损伤后P75表达，将有助于探索P75的功能以及NGF的作用机理。

多数报道认为周围神经系统的感觉神经元、运动神经元以及交感神经元在胚胎及生长发育时期表达P75，成年期不表达^［6，7］；也有报道认为成年基底前脑胆碱能神经元始终有P75表达，Rende^［8］和Hagg^［9］等研究认为坐骨神经损伤后，坐骨神经由原来的不表达变为大量表达。因此，本研究系统地研究坐骨神经损伤后，周围神经系统未表达P75的情况，并与周围神经系统损伤的情况作比较。研究的结果显示成年大鼠周围神经系统的运动神经元胞体、感觉神经元胞体以及坐骨神经正常情况不表达P75，当周围神损伤后，如坐骨神经损伤，周围神经系统的运动运动神经元胞体、感觉神经元胞体以及坐骨神经重新表达P75。为什么会出现这种现象?Takahashi^［10］等认为P75是肿瘤坏死因子受体家族成员，这个家族包括TNFR1、TNFR2、CD40、Fad、OX40、CD27、4-1BB和CD30。这个家族成员在细胞外区含3～6个半胱氨酸的富集区，它们都是细胞膜受体。众所周知，TNFR可诱导细胞凋亡，因此，推测P75是否也有诱导细胞调亡的功能。在结构和功能上，这个家族成员中P75和CD40更与TNFR相似，当它们与其配体或单克隆抗体结合后，其活性就受到抑制。大量实验报道周围神经系统的感觉