【摘要】目的探讨平滑肌细胞对内皮细胞功能的影响，为内皮细胞种植的组织工程学提供理论基础。方法模拟血管壁的内层结构及内皮细胞与平滑肌细胞间的相互影响途径，建立内皮细胞与平滑肌细胞接触生长的联合培养模型，用免疫细胞化学、放射免疫学技术和图像分析等方法研究内皮细胞vWF、PGI₂、CD₂₉的合成、分泌及表达。结果联合培养的内皮细胞的Ⅷ因子相关抗原(vWF)的合成减弱，前列腺环素的分泌增加，整合素β₁亚族的表达增强。结论联合培养内皮细胞的细胞因子的合成、分泌和表达的变化更有利于其抗凝血及抗应力功能的调节。

【中图分类号】R318.01；R318.11【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)04-347

ANTICOAGULANT FACTORS AND ADEHISION FACTORS

OF ECs CO-CULTURED WITH SMCs

CHEN Shuang-hongJIANG Zong-laiZHANG YanZHANG Chuan-senLI Yu-quanCONG Xing-zhong

（Department of Anatomy, Institute of Biomedical Engineering,the Second Millitary Medical University, Shanghai 200433,China）

【Abstract】Objective Effects of smooth muscle cells(SMCs)on function of endothelial cells(ECs) has been studied in order to support the basic theory for tissue engineering to ECs seeding.Methods A new co-culture model of ECs-SMCs which mimicked the interior architecture of vessel and also imitated the interaction patterns between ECs and SMCs was established. Immuno-cytochemistry, radio-immunity and image analysis were applied in the research of synthesis, secretion and expression of von willebrand factor(vWF),prostacycline(PGI₂) and integrins β₁(CD₂₉)of the ECs. Results The production of vWF reduced, and the releasing of PGI2 and expression of CD₂₉ increased. Conclusion The change of the synthesis, releasing and expression of some factors of the ECs is beneficial to regulating the functions of anticoagulatnt and stress-resistance of the ECs in co-culture model.

【Key words】 Vessel; Endothelial cells; Smooth muscle cells; Co-culture; Prostacyclin;Von Willebrand factor;Integrins β₁

随着生物医学技术的发展，人工生物替代材料在心血管系统疾病治疗中的应用越来越多，改善生物材料与血液的相容性以减少生物材料诱发血栓和钙化形成已成为研究热点。内皮细胞是天然的保护层，种植于人工材料表面的内皮单层可以产生类似的在体效果。然而，内皮细胞种植技术一直存在未解决的问题，即细胞的抗凝血功能明显不足、抗应力能力弱，导致内皮细胞种植的成功率不高。进一步完善人工血管内皮细胞种植技术，是当前组织工程学所面临的一个重要课题。研究表明^［1］，完整的内皮细胞单层是防止血栓和钙化的前提，内皮细胞合成分泌许多因子，参与凝血和粘附过程。PGI₂是至今所知最强的血小板聚集和释放的抑制因子，vWF是血小板粘附于内皮下层所必不可少的因素，β₁粘附分子亚族是细胞与基质粘附的主要介导分子。因此，对内皮细胞中vWF、PGI₂、β₁粘附分子亚族的表达和活性的调节，将直接影响种植内皮细胞局部血栓形成和内皮细胞的粘附能力。国内外已有的研究中，对联合培养条件下，平滑肌细胞如何调节和影响内皮细胞的凝血因子和粘附分子的合成、分泌和表达，尚未见报道。本研究在建立内皮细胞与平滑肌细胞联合培养模型的基础上，对其中内皮细胞的凝血因子和粘附分子作了进一步研究，以探讨平滑肌细胞对内皮细胞功能的影响，为完善人工皮内细胞种植的组织工程学技术提供理论依据。

材料和方法

1.内皮细胞和平滑肌细胞的联合培养

新生牛胸主动脉5～10cm，胶原酶(Sigma公司)和胰酶(Sigma公司)混合消化，获取内膜的内皮细胞；胰蛋白酶消化，获取中膜的平滑肌细胞。原代培养，传代至2～10代的平滑肌细胞经胰酶消化，调整细胞浓度到5×10⁴个/ml，种植于PET膜(美国Falcon公司)的外面；在膜的内面以同样的浓度种值2～10代的内皮细胞，然后将PET膜插入配套的6孔培养板(美国Falcon公司)中，进行联合培养^［2］。同时以单独培养的内皮细胞和在平滑肌细胞的条件培养基中培养的内皮细胞分别作为对照。

2.内皮细胞Ⅷ因子相关抗原的免疫细胞化学

取2、4、6、8d 3种培养条件下的内皮细胞各1组，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定25～30min，羊血清(Sigma公司)37℃、30min，兔抗人vWF(Sigma公司)37℃、60min，羊抗兔第二抗体(Sigma公司)37℃、60min，A液B液各37℃、30min(ABC试剂盒，华美生物工程公司)，DAB呈色。

3.内皮细胞前列腺环素(PGI₂)的放射免疫检测

传代的内皮细胞，以5×10⁴个/ml的浓度种植于3种培养条件的多孔PET膜上，每个膜孔加培养基2ml，每天收集各组培养基0.6ml，弃去多余培养基，加入新鲜培养基。收集的培养基离心后，置于-20℃冰箱保存，标本收集齐后，按试剂盒操作(6-酮-PGF_1a试剂盒，苏州医学院血栓与止血研究所)，测定6-酮-PGF^1a的含量作为PGI₂的含量。

4.内皮细胞整合素β₁亚族(CD₂₉)的免疫细胞化学

取上述3种培养条件下8～72h生长的内皮细胞各1组，PBS洗3遍，4%的多聚甲醛固定后，羊血清(深圳晶美生物工程公司分装)37℃、30min，鼠抗人CD₂₉抗体(深圳晶美生物工程公司分装)，羊抗鼠第二抗体(Sigma公司)37℃、60min，A液B液各37℃、30min(ABC试剂盒，华美生物工程公司)，DAB呈色。

5.图像分析

每组标本取50个细胞，测出每个细胞的灰度值后，取其平均值。组间的比较用t检验。

结果

1.内皮细胞的Ⅷ因子相关抗原(vWF)

三种培养条件下的内皮细胞vWF均为阳性反应，阳性颗粒主要集中在细胞质中，细胞核空染。其中单独培养内皮细胞的阳性颗粒明显强于条件培养细胞，联合培养的内皮细胞最弱。图像分析结果表明，单独培养的内皮细胞胞浆中vWF的灰度值较同期条件培养的内皮细胞小，即vWF的合成增多。而联合培养的内皮细胞灰度值最大，即vWF合成最少，同时相的3组结果有显著性差异(P＜0.05)，图1，2。

图1内皮细胞vWF免疫细胞化学显色的灰度

A.单独培养的内皮细胞B.条件培养的内皮细胞

C.联合培养的内皮细胞；(AvsC P＜0.05)

(AvsC P＜0.01)＃(AvsB P＜0.05)

＃＃(AvsB P＜0.01)※(BvsC P＜0.05)

※※(BvsC P＜0.01)

Fig.1 Immuno-cytochemistry gray of vWF in ECs

A，ECs cultured alone B, ECs cultured in

condition media C,co-cultured ECs.

*(AvsC P＜0.05)**(AvsC P＜0.01) ＃(AvsB P＜0.05)

＃＃(AvsB P＜0.01) ※(BvsC P＜0.05) ※※(BvsC P＜0.01)

图2内皮细胞VWF免疫细胞化学。A.单独培养的内皮细胞B.条件培养的内皮细胞C.联合培养的内皮细胞DAB染色×40

Fig.2 Immuno-cytochemistry staining of vWF in ECSs. A,ECs cultured alone B,ECs cultured in condition media C,co-cultured ECs Dyed by DAB×40

2.内皮细胞的前列腺环素(PGI₂)

PGI₂是前列腺素代谢途径的一个重要产物，性质极不稳定，半衰期很短，约3．5～30min，衰退后很快转变成为没有活性的6-酮-PGF_1a，该产物性质相对稳定，本实验用I¹²⁵标记的6-酮-PGF_1a抗体，检测培养基中6-酮-PGF_1a的含量代替PGI₂的累积量。放射免疫法检测发现，联合培养的内皮细胞的培养基中6-酮-PGF_1a的含量最高，条件培养内皮细胞的次之，单独培养内皮细胞的最低，同期3组之间相比具有显著性差异(P<