【摘要】目的寻找人绒毛膜上皮癌(JAR)与孕早期绒毛组织间的差异基因。方法采用mRNA差异显示法(mRNA differential display PCR, DD-PCR)，即分别提取正常孕早期绒毛及绒毛膜上皮癌的总RNA，在oligodT₁₅作用下分别合成相应的cDNA，并以其为模板利用试剂盒中的20对引物组合和α-³²PdATP，Taq酶等进行PCR，将两者的PCR产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶(PAG)上电泳，放射自显影后寻找两者间的差异片段，回收差异片段进行二次PCR，对二次PCR产物先采用反杂交法初步筛选后再用Northern Blot鉴定。结果从PAG上切下32条差异条带，经反杂交初步筛选出11个阳性片段，对11个阳性片段分别做Northern Blot鉴定，其中1个片段(T26)的基因长度约1.2kb，其在绒毛膜上皮癌中的表达远高于正常绒毛组织。结论T26基因片段可能是绒癌相关基因。

【中图分类号】R737.33【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)04-

mRNA DIFFERENTIAL DISPLAY POLYMERASE CHAIN

REACTION WAS USED TO IDENTIFY DIFFERENTIAL

GENES BETWEEN CHORIOCARCINOMA AND THE FIRST

TRIMESTER VILLI TISSUE IN HUMAN

SHI Gui-zhiGAO Ying-mao

（Department of Histology and Embryology of Shandong Medical University, Jinan 250012）

GU Xiao-songLIU Mei

（Department of Neuroscience Institute of Nantong Medical University,Nantong 226001,China）

WANG Bao-heng

（Department of Technology of High People's Court of Shandong Province, Jinan 250014, China）

【Abstract】Objective To identify differential genes between choriocarcinoma and the first trimester villi tissue in human.Methods mRNA differential display PCR(DD-PCR) was used. First both total RNAs were isolated and reversely transcribed into cDNAs respectively with oligodT₁₅, then these cDNAs were gone through PCR by using primer pairs from Delta^TM Differential Display kit, α-³²PdATP and Taq DNA Polymerase. The products of PCR were run on 6% denaturing polyacrylamide gels(PAG) and autoradiograms were examined to find the differential bands between both gels. The differential bands were reamplified using the same PCR condition as before. Reverse dot blot procedures and Northern analysis were used to identify the bands. Results From PAG 32 differential bands of choriocarcinoma were cut, from which 11 bands were identified through reverse dot blot procedure. Northern analysis showed that one band(T26) was much stronger in choriocarcinoma than in normal villi, its mRNA size is about 1.2kb. Conclusion Differential band T26 may have relevance with choriocarcinoma.

【Key words】 DD-PCR; Choriocarcinoma(JAR);Villi;Human

胚胎孕早期绒毛滋养层细胞的发育与肿瘤细胞的增殖、分化及侵蚀性等方面有许多相似之处^［1］。由于各种因素的影响，滋养层细胞过度增殖可恶化发展为绒毛膜上皮癌。目前对其发生机理尚不清楚。为了从分子水平上研究其致病机理，本研究采用近年发展起来的差异显示PCR技术^［2］，比较了胚胎孕早期绒毛滋养层细胞与绒毛膜上皮癌(JAR)之间的基因表达差异，尤其是寻找肿瘤相关基因，进而对肿瘤的发生机理研究提供帮助。

材料和方法

1.标本来源

正常孕早期胎盘绒毛组织(孕50d至60d，自停经算起)取自南通医学院附属医院人流室；绒毛膜上皮癌细胞株(JAR cell line)购自上海细胞生物研究所。

2.提取总RNA及电泳鉴定

2.1提取总RNA：按Trizol^TM Reagent (GIBCO)说明进行。取100mg左右正常流产绒毛组织及培养的绒癌细胞，分别加入Trizol反应液1.5ml匀浆，室温静置5min，加入0.3ml氯仿，充分震荡15s，室温静置2min，12 000×g 4℃ 离心15min。取上清，加入等体积的异丙醇，室温静置10min，12 000×g 4℃离心10min，弃上清，加入1.5ml 75%乙醇混旋沉淀，7 500×g 4℃离心5min，弃上清，晾干后，加入适量DEPC水溶解(65℃促溶15min)。测A 260/A 280，当比值大于1.7时进行下一步实验，以保证RNA的高纯度；根据A 260值计算RNA含量，RNA含量(g/L)=A 260×RNA稀释倍数×40 mg/L÷1 000。

2.2RNA电泳：用1×甲醛凝胶电泳缓冲液(20mmol/L MOPS， 8mmol/L 乙酸钠，1mmol/L EDTA)配制1%琼脂糖凝胶。调整两者RNA的浓度相同，取RNA溶液4.5μl(约30μg)；依次加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0μl；甲醛3.5μl；去离子甲酰胺10μl,65℃变性15min，冰浴5min。加溴化乙锭(EB，1g/L)1μl，凝胶上样缓冲液2μl，混合后加入凝胶样品孔中。调整电场强度5V/cm，电泳2～3h。使用SH-100图像分析系统(上海四星生物公司)摄片记录结果后转尼龙膜。

2.3转膜：按毛细管转移法将凝胶中的RNA转移至与凝胶大小一致的尼龙膜上，80℃真空干烤2h，4℃真空保存。

3.逆转录

正常绒毛及绒癌标本分别做一相应副管。调整上述RNA含量至1g/L，取2μl为模板，加入Oligo(dT)₁₅引物(10μmol/L，上海植物生理研究所合成)1μl；焦碳酸二乙酯(DEPC)水3.5μl，混匀70℃ 10min，冰浴，依次加入下述试剂：10×反应缓冲液1μl；MgCl₂(25 mmol/L)1μl; dNTP混合物(10 mmol/L)0.5μl;0.1mol/L二硫苏糖醇(DTT)1μl;Superscript RT Ⅱ（2×10⁸U／L，GIBCO）0.5μl，混匀后离心，42℃ 50min,70℃ 15min，－20℃储存。

4.PCR

在每一反应管中加入如下物质：10×反应缓冲液2μl;dNTP(2mmol/L)0.5μl;Delta^TM Differential Display Kit(CLONETECH)中锚定引物T1～T9之一(20μmol/L，例如引物T8序列：5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGC-3'，引物T1～T9除3’端2个碱基不同外，余相同)1μl，随机引物P1～P10之一(20μmol/L，例如引物P10序列：5’-ATTAACCCTCACTAAAGCACCGTCC-3'，引物P1～P10除3’端9个碱基不同外余相同)1μl，1∶10稀释的逆转录产物1.5μl；灭菌双蒸水13μl；Taq酶(2×10⁶U/L，Bio star international, Canada)0.5μl;α-³²PdATP(3000Ci/mmol,北京市亚辉生物医学工程公司)0.5μl。循环参数如下：第1个循环：94℃ 5min，40℃ 5min，68℃ 5min；第2～3个循环：94℃ 30s，40℃ 30s，68℃ 5min；第4～36个循环：94℃ 20s，60℃ 30s；68℃ 2min；最后68℃延伸7min。反应结束后即刻电泳。

5. 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及放射自显影

5.1配制6%变性聚丙烯酰胺凝胶：用1×TBE电泳缓冲液(89mmol/L Tris碱；89mmol/L硼酸；2mmol/L EDTA)配制6%变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺：N，N-亚甲双丙烯酰胺＝19∶1；7 mmol/L尿素)，用前取50ml加临时配制的25%过硫酸铵(AP)50μl，N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)50μl。混匀后灌入安置好的测序板内(Bio-Rad Ltd.)室温凝聚3h。

5.2电泳：将测序板装入电泳仪中，灌入1×TBE缓冲液，设置恒定温度为50℃，100W功率预电泳30min；停止预电泳，取前述PCR产物加等体积聚丙烯酰胺凝胶上样缓冲液［98%去离子甲酰胺；20mmol/LEDTA(pH 8.0)；0.05%二甲苯青；0.05%溴酚蓝］，94℃ 2min，上样。按预电泳条件电泳3h至二甲苯青达电泳槽底。

5.3放射自显影：将凝胶干燥，－70℃曝光适当时间，显影，定影。寻找正常绒毛组织与绒癌细胞之间的差异条带。

6.差异片段的回收及二次PCR

6.1回收差异片段：从凝胶上精确切下差异条带，加50μl灭菌双蒸水，100℃煮沸15min，将上清转至新的离心管中，-20℃储存。

6.2二次PCR：在0.5ml PCR管中建立扩增体系，除模板(回收的DNA)为3μl，不加同位素外，余条件同第1次PCR。

7.点杂交法(反杂交)初步筛选阳性差异条带

7.1点膜：取二次PCR产物及阳性对照(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，GAPDH)，分别加等体积A液(0.8mmol/L NaOH,20mmol/L EDTA),100℃ 10min，0℃冰浴，依次序将GAPDH及所有2次PCR产物分别点尼龙膜；加样后每孔用0.4mmol/L NaOH 500μl漂洗，2×SSC稍加漂洗后晾干，室温保存。

7.2探针标记：依照Prime-a-Gene^○R Labeling System(Promega)试剂盒中说明进行。取绒癌逆转录后的第1链4μl(约20ng)，94℃ 3min，0℃冰浴中加入下列物质：dGTP,dTTP,dATP混合物2μl、10g/L BSA 1.0μl,5×标记缓冲液(Kit提供，内含随机寡脱氧核苷酸)5.0μl、α-³²PdCTP(3 000Ci/mmol)3<