【摘要】目的试图通过方法改进获得高纯度原代多巴胺能神经元，并研究Matrigel及多聚左旋赖氨酸(poly-l-lysine,PLL)等不同基质对于大鼠胚胎13d中脑黑质神经元突起生长的不同作用。方法无菌技术取得孕13d SD大鼠胚胎，采用改进的取材方法，得到胎鼠腹侧中脑细胞，以较高密度(1×10⁵/cm²)分别种入由Matrigel及PLL作为基质的塑料培养皿中。体外培养5d后，对培养物进行TH免疫细胞化学染色，测量TH免疫反应突起的长度并计算TH免疫反应神经元占细胞总数的比例。结果和结论1.采用改进的方法，能够得到高纯度的多巴胺能神经元(多巴胺神经元占培养细胞总数的比例为15%)；2.与PLL相比，Matrigel能有效地促进多巴胺能神经元突起的生长，但不能特异地促进中脑培养细胞的存活。

【中图分类号】Q421；Q8134.1⁺1【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)04-307

STUDY OF FACTORS AFFECTING PRIMARY CULTURE

OF DOPAMINERGIC NEURONS IN RAT FETUS

CHEN Li-nan

（Department of Anatomy,Beijing Medical University,Beijing 100083,China）

XU Qun-yuanLü JieZHANG Jin-lu

（Beijing Institute for Neuroscience,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100054,China）

【Abstract】Objective In order to obtain high purity of primary culture of dopaminergic neurons in rat fetus,we tried to modify the culture procedure.Using improved techniques,we compared the growth status of dopaminergic neurons cultured on Matrigel and PLL(Poly-L-Lysine)substrates.Methods The DA neurons were obtained from the ventral mesencephalon of SD rat embryos(E13) by using a different dissecting method and then plated in plastic dishes coated with Matrigel and PLL substrates in high density (1×10⁵/cm²).After cultured for 5 days in vitro,TH immunocytochemical staining was performed and length of TH immunoreactive neurites was measured. Results and Conclusions 1.Cultured dopaminergic neurons in high-purity(dopaminergic neuron/all neuron=15%) could be got by using this improved culture method.2. Matrigel substrate promoted neurites outgrowth of cultured neurons more potently than PLL substrate,but did not increase the survival of the neurons.

【Key words】 Primary neural cell culture; Dopaminergic neuron; Poly-L-lysine; Immunocytochemistry; Matrigel

为探讨帕金森病的发病机理及治疗方法，常需在单细胞水平了解黑质多巴胺能神经元的生理生化特性及其对各种毒物、药物的反应。因此，高纯度、高质量、稳定地进行原代黑质多巴胺能神经元培养，是进行这一领域研究的关键技术。

大鼠胚胎黑质多巴胺能神经元的原代培养有相当难度。据报道，在胚胎中脑原代细胞培养中所得到的多巴胺能神经元所占的比例一般较低，多为0.5%～2%^［1，2］(仅有一个实验室报道达到了17%^［3］)；另外，这些体外培养神经元的形态和功能与体内有较大差异。这些都会影响体外实验结果的准确性。

产生上述现象可能与多种原因有关。首先，大多数作者使用的取材方法是取下整个胚胎中脑或中脑腹侧，从而不可避免地混有大量不含多巴胺能神经元的组织。其次，原代培养黑质多巴胺能神经元与培养的海马、大脑皮质神经元不同，较容易死亡^［4］。有报告说，胚胎黑质细胞在分散过程中即可造成30%的多巴胺能神经元死亡，接种后24h内死亡最多，为接种时存活的多巴胺神经元的60%，其后死亡进程延缓，第3d为87%^［5］。尽管不同作者所报告的数字略有差异，但第3d死亡数至少要达50%以上^［6］，第8d则超过75%^［7］。另外，多聚左旋赖氨酸虽然常被用作体外培养的基质，但并不是细胞外基质的成分，其作用仅仅是通过改善培养皿的电荷状况及吸附培养液中的某些血清成分，以促进细胞贴附^［8］，从而造成神经元的生长形态及功能的不稳定性。

为此，我们在本实验中，拟从取材部位、细胞接种液和培养基质3方面对黑质多巴胺能神经元的技术进行改进，旨在能够获得较高纯度及较高质量的原代黑质多巴胺能神经元培养物。

材料和方法

1. 收集3T3成纤维细胞系条件培养液

在玻璃培养瓶中，以含胎牛血清10%(Gibco)，青霉素10⁵IU/L，链霉素100mg/L，葡萄糖4.5g/L的DMEM(Gibco)培养3T3成纤维细胞系。换液时，收集旧培养液，2 000×g离心5min。取上清，储存于4℃，用作黑质神经元原代培养接种液中的添加剂。

2. 铺敷生长基质

2.1Poly-L-Lysine:在35mm塑料培养皿(Nunc,USA)中加入50mg/L的PLL 0.5ml(Sigma,MW=70～150kD)，室温作用12～24h后，吸去多余液体，用无菌去离子水彻底冲洗3次，置于37℃培养箱(Heraeus,Germany)中待用。

2.2Matrigel:4℃，24h融化Matrigel(Becton Dickison Labware,USA)，用不含血清的预冷培养液按1∶100稀释，然后用预冷的吸管混匀，在预冷的35mm塑料培养皿中加入Matrigel稀释液0.5ml，37℃培养箱孵育1h后，吸去多余的液体，并用无菌去离子水冲洗1次后，即刻使用。注意切勿使铺敷的Matrigel干燥。

3. 胚胎黑质神经元取材

取孕13d SD大鼠1只(北京医科大学实验动物中心，以见阴栓为第0d)，心脏内直接注射气栓处死；无菌条件下取出子宫，用冰D-Hank液洗净，再经75%酒精洗浴30s，置于盛有冰D-Hank液的平皿中；沿子宫系膜对侧缘剪开子宫，取出胚胎，测量头臀距(CRL)为11mm，共15只，置于冰袋上盛有冰D-Hank液的平皿中待用。在解剖镜(Cambridge Instruments,Germany)下，暴露中脑脑曲；用显微手术剪剪下中脑脑曲腹侧部分(其吻侧界限为中脑与间脑的交界线的尾侧1mm)，将取下的组织平铺在平皿中，用显微手术镊剥除脑膜及血管，用显微手术剪剪下其距吻侧端1mm中线两侧各1.5mm×1.5mm的组织(所取组织块长宽分别为1.5mm和3mm)，放入盛有冰D-Hank液的平皿中，静置于冰袋上待用。整个取材时间(从取出大鼠子宫到全部取材完成)不超过45min。

4. 原代神经细胞培养

吹打液：含10mg/L的DNase Ⅰ(Sigma)的D-Hank液，pH7.4； 接种液：含胎牛血清10%(Gibco)、3T3成纤维细胞系条件培养液10%(自制，见前述)、青霉素10⁵IU/L、链霉素100mg/L、葡萄糖4.5g/L的DMEM(Gibco)，pH7.4；培养液：含胎牛血清10%(Gibco)、青霉素10⁵IU/L、链霉素100mg/L、葡萄糖4.5g/L的DMEM(Gibco)，pH7.4。

取材全部完成后，将组织移入已预温至37℃含有0.1%胰蛋白酶(Sigma)1ml的玻璃小管中，静置于37℃温箱消化20min；加入1滴胎牛血清(Gibco)，混匀以终止消化，另外再加入10mg/L的DNase Ⅰ 1ml，混匀；片刻后，在室温以100×g离心60s，小心移去上清，加入预温至37℃的吹打液1ml，以口径为1mm的吸管吸打10次，然后以口径为0.5mm的吸管再吸打10次，在以上吸打过程中勿产生气泡；静置5min，将上清(约为总体积的9/10)吸至1个新的5ml玻璃小管中。取1μl细胞悬液，加入8μl缓冲液及1μl的10×台盼蓝混匀，镜下以见圆形、透亮、有光晕的细胞体作为活细胞的辨认特征(死亡细胞为蓝色)，计数得细胞存活率为90%，活细胞密度为1.5×10⁷/ml；然后按照每个35mm平皿接种1×10⁶细胞的密度(约合1×10⁵/cm²)用接种液稀释，混匀后，每个35mm平皿加入1ml细胞悬液，24h后将接种液全部弃去，加入不含3T3成纤维细胞系条件培养液的正常培养液1.5ml，培养第3d时半量换液，同时加入阿糖胞苷8mg/L(Sigma)。

5.酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色

抗体稀释液：含5%封闭用羊血清(北京中山生物技术公司)及0.1% Triton X-100(北京中山生物技术公司)的D-PBS;DAB稀释液：50mg/L Tris-HCl,pH7.4。

第5d终止培养，D-PBS冲洗5min×3；新鲜配制的1%多聚甲醛(北京化学试剂公司)溶液室温固定30min，D-PBS冲洗5min×3；1%的过氧化氢(北京化学试剂公司)溶液室温作用30min，D-PBS冲洗5min×3；加入5%封闭用羊血清室温30min，D-PBS冲洗5min×3；加入抗大鼠TH单克隆抗体(1∶1000,Sigma,以抗体稀释液稀释)，37℃下作用2h，D-PBS冲洗3min×3；加入用抗体稀释液稀释的羊抗小鼠生物素化二抗(1∶100，Zymed Laboratories Inc.,USA),37℃下作用15min，D-PBS冲洗3min×3；加入以抗体稀释液稀释的Streptavidin-HRP复合物(1∶100，Zymed Laboratories Inc.,USA),37℃作用15min，D-PBS冲洗3min×3；DAB稀释液冲洗3min，进入0.05% DAB(Sigma)/0.3%过氧化氢孵育液中，在倒置显微镜下观察显色7min。

6. TH免疫反应神经元形态观察

6.1TH免疫反应神经元占全部培养细胞的比例：在<