【摘要】目的探讨微囊化转酪氨酸羟化酶(TH)基因的细胞在帕金森病(PD)大鼠模型脑内存活、组织反应及对异常行为的治疗效果。方法以人TH基因作为目的基因，重组到逆转录病毒载体感染人成纤维细胞，将细胞包裹在APA半透膜中进行微囊化后，植入6-羟多巴胺单侧损毁的PD大鼠模型纹状体内，观察移植物的存活状况和功能作用16周。结果体外和植入体内的微囊化转基因细胞具有良好的存活能力。移植微囊化细胞可以使大鼠异常运动明显改善，移植位点周围的免疫反应较小。结论微囊化对转基因细胞异种移植以进行基因治疗具有显著意义。

【中图分类号】R74.25【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)04-317

AN EXPERIMENTAL STUDY ON GENE THERAPY WITH

INTRACEREBRAL TRANSPLANTATION OF MICROCAPSULATED

HUMAN FIBROBLASTS EXPRESSING TH GENE

IN RAT MODEL OF PARKINSON DISEASE

DAI Xiao-lingZHANG Jin-luXU Qun-yuanZHAO Chun-liZHAO Huan-yingSUN Xiao-hongZHENG Shao-peng

（Beijing Institute for Neuroscience, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100054, China）

【Abstract】ObjectivesThe aim of this study was to evaluate the survival of the grafts, their immune response from hostissue and improvement of the locomotion after the intracerebral transplantation of microcapsulated genetically modified cells in the rat model of Parkinson Disease(PD).MethodsThe human tyrosine hydroxylase(TH) gene was recombined into a retrovirus vector and the newly constructed vector was then transfected into primary cultured human fibroblasts in vitro.These human fibroblasts were microcapsulated by the alginate-polylysine-alginate(APA)semipermeable membrane. The rat model of PD was made by unilateral 6-OHDA injection in the midbrain. These microcapulated genetically modified human fibroblasts were transplanted into the brain of the rat models. ResultsThe microcapsulated cells could survive well in vivo at least 16 weeks. The grafting of these cells could induce a marked decrease in abnormal locomotion for the animal models and make a less immunorejection from host tissue. ConclusionThe APA-microcapsulation may help gene therapy by use of xenograft with genetically modified cells.

【Key words】Parkinson disease; Gene therapy; Tyrosine hydroxylase; Human fibroblast; Microcapsule; Rat

帕金森病(Parkinson Disease, PD)的主要病理特征为中脑黑质多巴胺(dopamine, DA)能神经元变性，使纹状体内的DA显著减少而出现一系列临床症状。将分泌多巴胺的胚胎中脑细胞或肾上腺髓质细胞进行纹状体内移植，能一定程度地逆转或改善患者的症状。此外，新近发展起来的基因治疗方法，即利用各种转基因技术，将外源性基因如DA合成限速酶-酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因转入某种体外培养的细胞内，再将此基因工程细胞植入模型动物脑内，使之在纹状体表达TH^［1，2］，而达到提高DA水平的目的。但是，大量研究证明，无论用哪种细胞植入脑内都存在宿主免疫排斥的问题，在进行同种异体基因和异种基因细胞移植中尤为显著^［3］。现有报道，将丙烯共聚物微囊植入大鼠脑内诱导的宿主组织反应较小。这种通过分子量界值为50 000道尔顿的微囊半透膜容许营养物质、生长因子和神经递质等小分子自由扩散，但能阻止大分子的免疫球蛋白和宿主细胞跨过微囊膜攻击移植细胞，从而对移植物提供免疫隔离^［4］，故用微囊包裹的细胞移植势必大大减少宿主的免疫排斥并提高移植物的存活率。据此，本研究拟对转TH基因的人成纤维细胞进行藻酸盐-多聚赖氨酸-藻酸盐(alginate-poly-lysine-alginate,APA)半透膜聚合物微囊包裹后植入大鼠纹状体内，以探求用成纤维细胞进行脑内异种移植治疗帕金森病实际应用的可能性。

材料和方法

1.大鼠PD模型的建立

将体重190～200g的雌性SD大鼠(首都医科大学实验动物部提供)用6%水和氯醛(0.05ml/kg腹腔注射)麻醉，置于脑立体定位仪行开颅手术；在脑内两点定位注射1%6-OHDA(6-hydroxydopamine, Sigma)各4μl^［5］，以损毁脑一侧黑质神经元。术后1周，大鼠颈部皮下注射Apomorphine(0.05mg/kg)，然后置于PD大鼠模型旋转记录仪^［6］上进行行为学检测。每周1次，每次40min，连续测量4周；出现向损毁对侧旋转次数大于7圈／min的大鼠可视为PD动物模型，共38只，供脑移植用。

2.运载细胞人成纤维细胞的培养

取临床消毒后流产胎儿(胎龄4个月)皮肤，剪碎后用0.1%胰蛋白酶消化30min，血清中和后离心去上清；Hank液洗1～2遍，用含10%胎牛血清的DEME培养基(DEME／FCS，Gibco／BL)反复吹打，制成细胞悬液；将其按5×10⁵的细胞密度接种于50ml培养瓶中进行培养。

3.带有TH基因的pLhTHSN质粒的重组

用两种DNA，即质粒pLXSN(逆转录病毒载体，海军总医院黄晋生博士惠赠)和质料pRcTH(含人TH基因，由美国Somatix Therapy Corporation提供)构建新的质粒pLhTHSN。用限制性内切酶EcoRI酶切pRcTH,回收并纯化1.8 kb片段作为人TH(hTH)基因的插入片段。用限制性内切酶EcoRI酶切pLXSN，用适量的CIAP进行脱磷酸反应作为逆转录病毒载体。将5.8kb的载体DNA片段和1.8 kb的目的基因片段纯化后，两者按照1∶3～5的比例加入连接反应体系中，在T₄ DNA连接酶作用(12℃，过夜)下进行连接反应，两者连接后可使hTH基因插入载体中。然后转化到XL₁-Blue大肠杆菌感受态细胞。挑选转化后过夜生长的12个连接转化菌落，用煮沸法从中小量提取质粒DNA，并用限制性内切酶EcoRI、XhoI和BamHI进行酶切和电泳分析，以验证质粒是否携带hTH基因和其插入方向是否正确。经确认后，用碱裂解法大量提取质粒pLhTHSN以用于基因转移。

4.pLhTHSN质粒转染培养的人成纤维细胞

用含hTH基因的逆转录病毒载体pLhTHSN用磷酸钙沉淀法转染单向包装细胞系ψ-2，48h后收集含ψ-2细胞出芽的病毒颗粒的上清，感染双相包装细胞系PA317；用G418对PA317进行筛选，对形成的抗G418细胞克隆分别进行扩增培养，并用抗人TH的单克隆抗体进行细胞免疫组织化学染色；当抗性细胞表现为TH免疫组织化学染色阳性而表明有TH基因表达后，大量扩增培养，收集病毒上清；用整合有pLhTHSN的PA317细胞克隆产生的病毒上清感染人成纤维细胞，用抗人TH抗体进行免疫组织化学染色；经证实能表达TH后，将细胞大量扩增，制成细胞悬液用于微囊化处理和大鼠纹状体内移植。

5.微囊化转人TH基因的成纤维细胞

将转染的人成纤维细胞送301医院临床基础研究所，用微囊静电发生器进行微囊化处理，微囊为APA微囊^［7］。

6.转入TH基因的成纤维细胞大鼠纹状体内移植

将PD大鼠模型作为宿主动物分为3组，微囊化人成纤维细胞移植组(Ⅰ组)和未微囊化人成纤维细胞移植组(Ⅱ组)各15只，空囊移植组(C组)8只作为对照组。3组动物均经腹腔注射6%水和氯醛(0.05ml/kg)麻醉，置于脑立体定位仪上，进行开颅手术。将上述转入TH基因的微囊化和未微囊化的人成纤维细胞，按照每只1×10⁶的细胞数，分别为15μl和20μl细胞悬液，分两点立体定位注射到大鼠PD模型一侧脑内纹状体(尾壳核)内。在对照组的大鼠脑内移植空囊悬液。

7.行为学及形态学检测

在经相同方法进行移植后，术后动物分别存活2～16周。对上述3组植入不同移植物的动物按照不同的存活时间分成小组，所有动物都在术后按前述制作模型的方法进行旋转实验。根据不同的存活期灌杀动物，即经升主动脉先注入温生理盐水200ml，然后注入4℃含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)250 ml；灌杀后立即取脑，置于含30%蔗糖的4%多聚甲醛中后固定24h后，进行冰冻连续切片(50μm)，将切片分组后分别行TH，胶质细胞酸性蛋白(glial-fibrillary-acidic-protein,GFAP)和CD8免疫组织化学染色，即顺序将切片入分别用小鼠抗TH抗体(1∶1 000，Sigma公司)、GFAP抗体和单克隆小鼠抗T细胞CD8抗体(1∶100，DAKO公司)作为一抗、用生物素标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶300,Vector公司)作为二抗和HRP标记的抗生物素复合物作为三抗的0.1mol/L磷酸缓冲液中，然后用含0.5%DAB的0.1mol/L磷酸缓冲液进行染色，以显示其免疫活性。染色后取部分切片进行焦油固紫复染。

结果

1.逆转录病毒载体pLhTHSN的构建

用质粒pRcTH和pLXSN新构建出来的质粒pLhTHSN经酶切分析，显示其均带有TH基因(1.8kb)；这些质粒用XhoI／BamHI双酶切分析，产生两个片段，即1.4kb和6.2kb，证明重组质