【摘要】目的探讨实验性铅中毒对睾丸组织神经生长因子(NGF)基因表达的影响。方法小鼠以0.5%醋酸铅自由饮服8周，测定血铅和睾丸铅含量。采用原位杂交法(以地高辛标记NGF DNA为探针)和RT-PCR方法，观察睾丸组织NGF mRNA含量的变化。结果铅染毒小鼠血铅和睾丸组织铅含量明显升高；原位杂交结果显示，铅染毒小鼠睾丸杂交信号明显减少；RT-PCR结果表明，铅染毒小鼠睾丸组织NGF mRNA表达量明显下降。结论铅中毒可使睾丸组织NGF基因表达量减少。探讨实验性铅中毒对睾丸组织神经生长因子(NGF)基因表达的影响。方法小鼠以0.5%醋酸铅自由饮服8周，测定血铅和睾丸铅含量。采用原位杂交法(以地高辛标记NGF DNA为探针)和RT-PCR方法，观察睾丸组织NGF mRNA含量的变化。结果铅染毒小鼠血铅和睾丸组织铅含量明显升高；原位杂交结果显示，铅染毒小鼠睾丸杂交信号明显减少；RT-PCR结果表明，铅染毒小鼠睾丸组织NGF mRNA表达量明显下降。结论铅中毒可使睾丸组织NGF基因表达量减少。

【中图分类号】R153.1【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)04-313

THE EFFECT OF LEAD POISONING ON NGF GENE

EXPRESS IN MOUSE TESTIS

DING fei

（Department of Hygiene Toxicology）

GU Xiao-songWANG Xiao-dongYAO Den-bing

（Institute of Neuroscience, Nantong Medical College, Nantong 226001，China）

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of the lead poison on the NGF gene expression in the testis of mouse. MethodsMice were exposed to 0.5% acetate lead for 8 weeks. The lead concentrations of blood and contents of testis were determined. Effects of lead poisoning on expression of NGF mRNA in testis were analyzed by in situ hybridization using NGF DNA probe labeled with digoxin and the reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) method. ResultsThe lead concentrations of blood and contents in testis of poisoned mice were increased. In situ hybridization indicated that hybridized signals in the testis of poisoned mice reduced significantly. The expression levels of NGF mRNA in the poisoned mouse testis were decreased.ConclusionLead poisoning could reduce NGF gene expression levels of mouse testis.

【Key words】Lead; NGF mRNA; Testis; Mouse

神经生长因子(nerve growth factor, NGF)是调节神经系统的重要生物活性分子之一。大量的实验证明它是神经元发育、分化、行使正常生理功能必不可少的营养分子^［1］。近年来不断有学者通过免疫组织化学的方法发现在小鼠、大鼠的睾丸、附睾以及豚鼠、兔、公牛的前列腺中也有NGF存在^［2～4］，提示NGF在生殖细胞的分化、发育和生理功能方面可能也具有重要的作用。我们在以往的研究中也发现，NGF在睾丸中具有自分泌与旁分泌作用的可能，并不断地促进精子自身的成熟，维持精子的活力^［5］。

铅作为一种重金属，不仅对机体神经、造血、消化、心血管等系统具有毒性作用，而且也可损害机体的生殖功能^［6］。有报道证实，铅作业男性精子数减少，精子活动力下降、精子畸形率升高^［7］。动物实验表明，铅中毒可使大、小鼠的睾丸组织发生组织病理学变化^［8］。但至今尚未见有关铅中毒对雄性动物生殖系统NGF影响的报道。本研究采用原位杂交和RT-PCR的方法，观察铅中毒小鼠睾丸组织中NGF mRNA含量的变化，以探讨铅对睾丸组织NGF基因表达的影响。

材料和方法

1.动物和试剂

健康雄性ICR小鼠，1月龄，由南通医学院实验动物中心提供。

限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、RNA提取试剂(Trizol)、第一链cDNA合成试剂盒(SuperScript^TM Preamlification System for First Strand cDNA Synthesis Kit)购自GibcoBRL公司；地高辛标记试剂盒(PCR DIG Probe Synthesis Kit)购自Bboehringer Mannheim公司；硫酸葡聚糖、鱼精DNA、甲酰胺等试剂购自Sigma公司；一般化学试剂购自上海试剂公司。

2.引物的合成

按NGF基因DNA序列，以中国科学院上海植物生理研究所合成的2个寡核苷酸为引物，其编码区为38～56和380～398，预期扩增产物为360bp。引物1：5’-GAATTCTCGGTGTGTGACA-3';引物2：5'-CTATCTCACAGCCTTCCTG-3'。以G3PD (甘油醛-3-磷酸脱氢酶Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase)作为内参，引物序列为：引物1：5’－GGTGAAGGTGGGTGTCAAC-3'；引物2：5’-TTCCCATTCTCAGCCTTGAC-3'。预期扩增产物长度为200bp。

3.铅中毒模型的制备

小鼠16只，随机分成2组(每组8只)：一组为正常对照组，以去离子水自由饮服；另一组为铅染毒组，以0.5%醋酸铅水溶液自由饮服，染毒时间为8周。

4.血铅、睾丸铅含量的测定及组织病理学检查

采用原子吸收分光光度法分别测定染毒组和对照组小鼠血铅和睾丸组织铅含量。取睾丸组织经HE染色，光镜检查。

5.Dig-β NGF DNA探针制备

将360 bp的β NGF DNA片段，克隆人pUC19质粒，转染JM13大肠杆菌，体外扩增，按碱性裂解法提取质粒DNA。将质粒DNA稀释后作为模板，采用上述NGF引物，在Cetus公司的PCR仪上，通过PCR DNA扩增，用直接标记法制备Dig-β NGF cDNA探针^［9］。

6.原位杂交

小鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉，生理盐水、4%多聚甲醛磷酸缓冲液灌流固定，取睾丸组织后固定，常规冰冻切片(厚约15 μm)，按文献^［9，10］的方法，进行原位杂交。

7.RT-PCR

7.1总RNA提取：采用Trizol试剂提取正常对照组和染毒组小鼠睾丸组织总RNA。每个样品均经甲醛变性胶电泳检测其RNA的完整性。采用日本岛津UV2200紫外分光光度仪，检测各样品中总RNA的含量。

7.2第1链cDNA的合成：分别取对照组和染毒组小鼠睾丸组织总RNA各5 μg,依次加入10μmol/L 01igo(dT)_12～18 1μl，DEPC水适量，使总体积达12μl，于70℃加热10min，冰浴2min。再加入：10×PCR缓冲液2μl、25mmol/L MgCl₂ 2μl、10mmol/L dNTPmix 1μl、0.1mol/L二硫苏糖醇(DDT) 2μl。轻轻混匀后于42℃孵育5min，再加入SuperScript Ⅱ反转录酶1μl(2×10⁶IU/L)，于42℃孵育50min。70℃加热15min终止反应。置-20℃保存备用。

7.3PCR：以第1链cDNA 2μl为模板，依次加入NGF引物(10pmol/L)各1μl，2mmol/L dNTPmix 4μl,10×PCR缓冲液 5μl，双蒸水34.5μl，TaqDNA聚合酶0.5μl(5×10⁶ IU/L)，反应总体系为50μl。95℃预变性3min。PCR反应条件为：95℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸40s，循环32次。每个反应体系中，均加入G3PD的一对引物(10pmol/L)为PCR扩增的内参。以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测NGF扩增产物(360bp)和G3PD扩增产物(200bp)。经凝胶图像分析系统，对各组RT-PCR产物的电泳条带进行密度分析。

结果

1.实验性铅中毒对血铅、睾丸组织铅含量的影响

铅染毒8周，小鼠的发育停止，精神痿靡。用火焰原子吸收分光光度法测定小鼠血铅及睾丸组织铅含量，采用t检验比较染毒组和对照组间的差异。结果表明，染毒组小鼠血铅浓度和睾丸组织铅含量明显高于对照组(P＜0.01)。结果见表1。

2.病理组织学观察

光镜下可见，对照组小鼠睾丸生精小管细胞5～7层，各层细胞分化明显，细胞排列紧密；而染毒组小鼠睾丸生精小管中生精细胞局灶性减少，细胞核固缩，空泡变性，细胞各层分化不明显(图1，2)。

3.原位杂交

原位杂交结果显示，正常成年小鼠睾丸生精小管管壁呈多处散在的杂交阳性反应，且基部较近腔部信号强；生精小管基膜也有较强的阳性反应，可能和此处的肌上皮有关。管腔中呈弱阳性，曲精小管间质有弱阳性反应。而铅染毒小鼠睾丸杂交信号明显减弱，仅局限于基底膜和基底的精原细胞或初级精母细胞上，曲精小管间质细胞无阳性反应(图3，4)。

图1正常小鼠睾丸HE染色，标尺示100μm

Fig.1The HE stainment of nomal mouse testes. Bar=100μm