【摘要】目的观察去甲二氢愈创木酸(NDGA)对胶质瘤细胞诱导的内皮细胞成型的影响并初步探讨其机理。方法采用在Ⅰ型胶原凝胶上的细胞立体培养和内皮-胶质瘤细胞的联合培养法，观测人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞或其条件培养基对人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞形成管腔样结构的影响，同时以免疫组织化学结合图像分析的方法检测SHG-44细胞VEGF、bFGF蛋白的表达。结果100μmol/L的NDGA作用1～3d后，SHG-44细胞VEGF、bFGF的表达明显降低。联合培养3d左右，胶质瘤SHG-44细胞及其条件培养基均能诱导内皮细胞在Ⅰ型胶原凝胶上拉长并形成管腔样结构；而100μmol/L的NDGA可明显抑制内皮细胞变长和管腔样结构的形成(P＜0.01)。结论NDGA对胶质瘤细胞诱导的血管成型有抑制作用，此作用可能与瘤细胞VEGF、bFGF表达减低有关，提示NDGA具有抗血管生成的作用。

【中图分类号】R361.3；R979.1【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)-04-359

THE EFFECT OF NDGA ON GLIOMA-INDUCED ENDOTHELIAL

TUBULAR MORPHOGENESIS AND ITS MECHANISM

SUN Hui-qinCHEN Yi-shengSHI Jing-quanBIAN Xiu-wu

（Institute of Pathology, Southwest Hospital）

ZOU Zhong-min

（Institute of Combined Injury,the Third Military Medical University, Chongqing 400038,China）

【Abstract】Objective To observe the effect of NDGA on glioma-induced tubular morphogenesis of endothelial cells, and its mechanism.Methods We applied the glioma-endothelial cell coculture and collegen I gel-based 3D culture to investigate the effect of NDGA on the formation of tubular structures of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)cell line ECV-304 cell, which was induced by human malignant glioma cell line SHG-44 or its conditioned media.Meanwhile the expression levels of VEGF and bFGF in SHG-44 cells were investigated using the techniques of immunohistochemistry and image analysis. Results The Human malignant glioma cell line SHG-44 after treated with 100μmol/L NDGA for 1 to 3 days showed that the expression of VEGF and bFGF was declined at protein levels. Either malignant glioma cell line SHG-44 or its conditioned media could induce ECV-304 cells to lengthen and form tubular structure on the gel of type I collegen. After addition of 100 μmol/L NDGA the length of endothelial cell and quantity of tubular structure, index of the glioma-induced morphogenesis of endothelial cells were significantly declined. Conclusion The above results suggest that NDGA suppresses the tubular morphogenesis and that the decreased expression of VEGF and bFGF may be the molecular mechanism of anti-angiogenesis effect of NDGA.

【Key words】 Anti-angiogenesis; Nordihydroguaiaretic acid(NDGA); Endothelial cells; Glioma; Coculture; Morphogenesis

实体瘤的生长、转移与肿瘤的血管生成(angiogenesis)有密切的关系，抗血管生成(antiangiogenesis)疗法是肿瘤治疗的新策略^［1］。在肿瘤的血管生成过程中，由瘤细胞产生的血管生成因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板源性生长因子(platelet-derived factor, PDGF),碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等，是启动和调控血管生成的重要介质。在胶质瘤，以VEGF和bFGF尤为重要^［2］，它们与内皮细胞上的特异性受体相结合，通过一系列的信号传递途径与机制，引起内皮细胞的增殖、迁移、成型等，从而实现血管生成过程。其中，内皮细胞的成型是决定血管生成的关键环节之一。

去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid, NDGA)是从常青灌木Larrea divaricata和Guaiacum officinale中提取的一种天然成分。近年发现其具有抑制多种肿瘤发生和发展的作用^［3～5］，我们既往的研究发现，NDGA对人恶性胶质瘤不但具有显著的抑制生长和诱导分化作用，而且亦能减低移植瘤和实验性胶质瘤的微血管密度^［6，7］，提示NDGA可能影响胶质瘤的血管生成，但尚未得到证实。本实验拟观察NDGA对胶质瘤细胞诱导的血管成型的影响，以探讨NDGA的抗血管生成效应，进一步阐明NDGA抗肿瘤机制。

材料和方法

1.细胞培养、胶质瘤条件培养基的制备

人脐静脉内皮细胞系ECV-304(ATCC CRI-1998)和人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞(引自苏州医学院附二院脑肿瘤研究室)，分别在含10%新生小牛血清(BS)、双抗的M199和RPMI1640培养基中常规培养。

条件培养基的制备：取等量贴壁生长的SHG-44细胞，弃去原培养基，以D-Hank液洗两次，各加入10ml 0.5%BS、M199液，其中1瓶内加入PBS(pH7.2)0.2ml，另1瓶内加入5mmol/L的NDGA 0.2ml(终浓度为100μmol/L)，培养24h后分别取上清，离心，经0.22μm微孔滤膜过滤，分别标记为条件培养基1、2(CM1，CM2)，－20℃无菌保存备用。

2.NDGA对SHG-44细胞血管生成因子VEGF、bFGF蛋白表达的影响

经NDGA(终浓度为100μmol/L)或PBS(pH7.2)处理后1～3d的SHG-44细胞，经4%多聚甲醛固定，采用SP法(Zymed公司产品)进行VEGF、bFGF(PcAb,1:20,Santa Cruz公司产品)的免疫组织化学染色。结果的判定与分析：以细胞浆呈明确的棕黄色为阳性染色，并用德国Leica公司MD20型真彩色图像分析仪进行图像分析。测定条件：目镜及物镜放大倍数各为×10、×25，随机测定100个细胞，分别测出阳性反应细胞的总面积(Area)和积分光密度(ⅠA)，然后求出平均光密度(A)值。

3.NDGA对胶质瘤细胞诱导内皮细胞成型的影响

3.1微孔滤膜培养小室及双室联合培养系统：双室联合培养是近年发展起来的一种新技术，采用该技术可观察两种细胞间的相互作用。本研究上室为PET微孔(孔径8μm)滤膜培养小室(falcon cell culture insert, Becton Dickinson产品)，用于接种内皮细胞；下室为12孔培养板，用于接种胶质瘤细胞。

3.2成型实验：(1)胶原凝胶的制备：胶原S(Boehringer Mannheim产品，Ⅰ型胶原＞95%)8份、10×M199培养基(pH7.3)1份、0.2 mol/L N-2-羟乙基呱嗪N′-2-乙磺酸(pH7.3)液1份于冰浴下迅速混合，涂布于所需的培养器皿底部，置37℃内形成凝胶，4℃无菌备用；(2)胶质瘤-内皮细胞联合培养及成型试验：SHG-44细胞传入12孔培养板内生长，ECV-304细胞传入铺有胶原凝胶的微孔滤膜小室内生长，近铺平时，装配小室(上室)于长有胶质瘤细胞的培养板(下室)内，在含有或不含NDGA(100μmol/L)的0.5%BS M199液中共同培养，观察细胞的变化并摄像记录成型情况；(3)条件培养基的成型试验：生长良好的内皮细胞传入铺有胶原凝胶的12孔板内生长，次日近80%铺平时，按50%和100%的比例各换为CM1、CM2，补加0.5%BS M199液至2ml/孔，后续观察处理方法同上；(4)管腔样结构数目及内皮细胞长度的测定：培养3d后，于倒置显微镜下随机计数每1视野(×160)内的管腔结构数。每孔计数10个视野，每组3孔，并重复试验3次。部分滤膜上的细胞，以4%多聚甲醛固定、HE染色后，用德国Leica公司MD20型真彩色图像分析仪测量分析，每1视野(×160)随机测定20个内皮细胞的长度，每1滤膜测量10个视野。

4.数据统计学处理

所有计量数据均以均值±标准差(±s)表示，采用Microsoft Excel提供的统计程序，进行两样本均数间显著性检验即t检验；计数资料采用χ²检验。P＜0.05为差异显著，Ρ＜0.01为差异非常显著。

结果

1.NDGA对SHG-44细胞VEGF、bFGF蛋白表达的影响

SHG-44细胞VEGF、bFGF蛋白表达均较强，主要定位于瘤细胞的胞浆。NDGA处理细胞1～3d后，SHG-44细胞VEGF、bFGF蛋白表达的阳性减弱，平均光密度(A)较对照组明显减少，统计学差异显著(P＜0.05)，如图1示。

图1NDGA处理不同时间后VEGF(左)、bFGF(右)蛋白的表达

Fig.1 The changes of VEGF(Left) and bFGF(Right) expression after NDGA treatment.

2.NDGA对胶质瘤-内皮细胞联合培养时内皮细胞成型的影响

当下室无胶质瘤细胞时，上室胶原凝胶层上的内皮细胞生长旺盛，多呈卵石样排列(图2a)；有NDGA存在时，则细胞较显稀疏，易见悬浮细胞及细胞碎片，未见明显的管腔样结构形成(图2b)。当下室有胶质瘤细胞存在并培养2～3d时，内皮细胞渐变长并可侵