【摘要】目的应用电镜定量方法探讨在吗啡依赖条件下，大鼠背根节感觉神经元发出的初级传入纤维能否在脊髓Ⅱ板层侧支出芽和建立新的突触。方法用光镜体视学方法测知吗啡依赖组和对照组大鼠L₄脊髓Ⅱ板层横切面积没有差异的情况下，直接比较了两组动物脊髓Ⅱ板层神经毡单位面积内突触性终末的数量变化。结果吗啡依赖组脊髓Ⅱ板层来自初级传入纤维的突触性终末数，明显多于对照组的初级传入纤维突触性终末数。其中来自无髓传入纤维的突触性终末数与对照组同类型的突触性终末数比较增加61%。来自有髓传入纤维的突触性终末数比对照组增多70%。尤其是来自含有致密核芯小泡的初级传入纤维突触性终末数比对照组多98%。结论吗啡可能促进初级传入纤维在脊髓Ⅱ板层侧支出芽和建立新的突触。应用电镜定量方法探讨在吗啡依赖条件下，大鼠背根节感觉神经元发出的初级传入纤维能否在脊髓Ⅱ板层侧支出芽和建立新的突触。方法用光镜体视学方法测知吗啡依赖组和对照组大鼠L₄脊髓Ⅱ板层横切面积没有差异的情况下，直接比较了两组动物脊髓Ⅱ板层神经毡单位面积内突触性终末的数量变化。结果吗啡依赖组脊髓Ⅱ板层来自初级传入纤维的突触性终末数，明显多于对照组的初级传入纤维突触性终末数。其中来自无髓传入纤维的突触性终末数与对照组同类型的突触性终末数比较增加61%。来自有髓传入纤维的突触性终末数比对照组增多70%。尤其是来自含有致密核芯小泡的初级传入纤维突触性终末数比对照组多98%。结论吗啡可能促进初级传入纤维在脊髓Ⅱ板层侧支出芽和建立新的突触。

【中图分类号】Q189【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)04-302

CHANGES OF SYNAPTIC TERMINAL NUMBER OF PRIMARY

AFFERENT FIBERS IN SPINAL CORD LAMINA Ⅱ OF

MORPHINE DEPENDENT RAT-AN EM QUANTITATIVE STUDY

ZENG Yuan-shanCHEN Sui-jun

（Division of Neurosciencens,Department of Histology and Embryology）

WU Jin-lang

（Electron Microscope Room）

ZHANG Hui-jun

（Departmeat of Anatomy,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089,China）

【Abstract】Objective Whether the primary afferent fibers given rise by sensory neuron in dorsal root ganglion of rat could make collateral sprouting and form new synapses in spinal lamina Ⅱ under the morphine dependence was explored with EM quantitative method.Methods The number of synaptic terminals in the unit area of neuropil of L₄ spinal lamina Ⅱ was compared between morphine dependent and control rats,because there was no significant change in the crosscut area of L-4 spinal lamina Ⅱ of two groups of animal,which was estimated by aid of LM stereological method. Results The number of synaptic terminals from primary afferent fibers in spinal lamina Ⅱ in morphine dependent group was significantly more than that in control group,among which the number of synaptic terminals from unmyelinated afferent fibers increased 61%.The number of synaptic terminals from myelinated afferent fibers was 70% more than that in control group.In particular,the number of synaptic terminals containing dense-core vescles from the primary afferent fibers went up 98% over that of control group. Conclusion Morphine may promote the collateral sprouting and synaptogenesis of primary afferent fibers in spinal lamina Ⅱ.

【Key words】 Morphine; Dependence;Spinal cord laminaⅡ; Primary afferent fibers; Synaptogenesis; Sprouting

Hendry等^［1］发现，吗啡依赖大鼠的脊髓组织提取液能促进体外培养的背根节神经元存活与生长，并推测该脊髓产生了某种神经营养活性物质。在此基础上，我们曾用吗啡依赖大鼠制作备用根模型(即切除动物一侧腰段背根和背根节，仅保留L₄背根作为备用根)，目的是观察经过吗啡作用的大鼠脊髓产生的微环境变化，对备用根初级传入纤维侧支出芽和突触重建的影响。结果发现，手术侧备用根初级传入纤维在脊髓后角Ⅱ板层内的侧支出芽和突触重建明显加快，起到代偿因切除大部分背根造成靶神经元在结构上和功能上去神经支配的作用^［2］。同时发现这种慢性注射吗啡的动物，没有切除背根侧(非手术侧)的L₄背根初级传入纤维也发生了侧支出芽^［3，4］。但还不清楚单纯吗啡依赖大鼠(不做备用根模型手术)的背根初级传入纤维，是否也像上述吗啡作用的备用根大鼠非手术侧背根初级传入纤维那样，以侧支出芽的方式进一步支配靶区。为此，本研究应用电镜定量方法，探讨在吗啡依赖条件下，大鼠的初级传入纤维能否在脊髓后角内侧支出芽和建立新的突触。这对了解造成吗啡依赖的形态学机制有重要的理论和实际意义。

材料和方法

1. 实验动物

10只SD雄性大鼠，体重约200g，分吗啡依赖组和对照组各5只。饲养在正常光、暗周期和笼养环境。

2. 吗啡依赖动物的制备

在吗啡依赖组大鼠腹腔内注射1%盐酸吗啡(青海制药厂产品)，每天2次。吗啡用量是^［1］：第1d 10mg/kg、第2d 20mg/kg,第3d 40mg/kg,第4d 60mg/kg,第5d 80mg/kg、第6d 100mg/kg，以后吗啡用量维持在每天100mg/kg。对照组大鼠仅在腹腔内注射生理盐水，每天2次。两组动物于第40d行灌注固定。

3. 取材和光镜及电镜标本的制备

用1%戊巴比妥钠(40mg/kg)经腹腔注射麻醉大鼠。将胸腔打开，经左心室主动脉插管，先快速灌注每100ml含1%亚硝酸钠0.2ml和肝素200U的生理盐水，接着用含有2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)灌注固定。取出连同背根的腰骶段脊髓，切取一侧L₄脊髓后角，置入上述新鲜固定液，4℃过液。再入1%锇酸后固定2h，树脂包埋。用钻石刀切取包含整个Ⅱ板层的横切超薄切片，裱于400目铜网上，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色。并于紧邻超薄切片处切取半薄切片，裱于载玻片上，甲苯胺蓝染色。

4. 测量、摄片和计数

半薄切片上辨认脊髓后角Ⅱ板层横切面的要点是：Ⅱ板层呈均匀一致的浅染区，内侧份有背腹走行的有髓纤维束(图1)。应用体视学点计数法，在光镜下测量半薄切片上Ⅱ板层横切面积。在H600透镜电镜(×300)下，按位置关系将Ⅱ板层所占的铜网孔勾划于相应的方格纸上。再于×8 000下,在Ⅱ板层每个铜网孔的上、下处各拍摄1张神经毡的照片。每例动物一侧Ⅱ板层的超薄切片上平均拍摄19张照片。在电镜照片上辨认和计数两类突触性终末，即主要来自背根初级传入纤维的复合终末(CT)和主要为非背根神经纤维来源的简单终末(ST)^［5～8］。为区分两类终末，仅计数有明确突触性连接，并有3～5个以上突触小泡靠近突触前膜的终末^［8］；与1个以上的突触后成分形成突触者计为CT，仅与1个突触后成分形成突触者计为ST^［8］。以上各项数据均经两样本均数t检验，求出P值。

结果

1. 吗啡依赖大鼠的行为变化

吗啡依赖组大鼠在注射吗啡第7d后，开始对钳夹其皮肤的刺激表现出异常躁动，并随着注射吗啡的次数增加而变得更加明显。在同笼的大鼠之间受到刺激时，较容易出现打斗现象(图2)。然而对照组大鼠的行为较为温驯，即使在注射生理盐水期间，也不会因受刺激而发生攻击行为。

2. L₄脊髓后角Ⅱ板层横切面积

表1显示，吗啡依赖组大鼠L₄脊髓后角Ⅱ板层的横切面积与对照组大鼠的比较，没有显著性差异。因此，直接比较两组大鼠L₄脊髓后角Ⅱ板层恒定单位面积(相当于108μm²)神经毡内突触性终末的数量变化，应能反映整个Ⅱ板层神经毡内突触性终末的数目变化，这为本研究抽样定量的可比性提供了依据。

3. Ⅱ板层神经毡突触性终末

两组动物L₄脊髓后角Ⅱ板层神经毡内，常见各种形态的ST(图3)和CT(图4～6)。还可见轴突、轴突终末、树突和树突棘之间的间隙填充着神经胶质细胞的胞突。此外，一些突触性终末内含致密核芯小泡在非突触部位紧靠轴膜分布。本研究在实际面积为108μm²的照片上，对Ⅱ板层神经毡单位面积内各类突触性终末的数目作了定量分析。

表1两组大鼠脊髓Ⅱ板层横切面积(±s，测试点数)的比较