【摘要】目的进一步分离纯化备用根大鼠部分去传入纤维支配(手术侧)的脊髓后角组织提取液，以获得某种神经营养活性物质。方法用Superdex G-75 prep grade凝胶层析、高效液相色谱(HPLC)层析和细胞培养等技术分离和检测神经营养活性物质。结果手术侧脊髓后角组织提取液经Superdex G-75 prep grade凝胶层析和HPLC层析后，得到的A峰洗脱液具有促进体外培养鸡胚背根节(DRG)分离神经元存活及其神经突起生长的神经营养活性作用。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)显示，A峰洗脱液呈现一条分子量约为60 kD的蛋白质主带。结论结合生物活性检测结果，分子量约60 kD的蛋白质可能是手术侧脊髓后角组织的神经营养活性物质。进一步分离纯化备用根大鼠部分去传入纤维支配(手术侧)的脊髓后角组织提取液，以获得某种神经营养活性物质。方法用Superdex G-75 prep grade凝胶层析、高效液相色谱(HPLC)层析和细胞培养等技术分离和检测神经营养活性物质。结果手术侧脊髓后角组织提取液经Superdex G-75 prep grade凝胶层析和HPLC层析后，得到的A峰洗脱液具有促进体外培养鸡胚背根节(DRG)分离神经元存活及其神经突起生长的神经营养活性作用。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)显示，A峰洗脱液呈现一条分子量约为60 kD的蛋白质主带。结论结合生物活性检测结果，分子量约60 kD的蛋白质可能是手术侧脊髓后角组织的神经营养活性物质。

【中图分类号】Q189【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)04-322

THE ISOLATION AND BIOACTIVE ASSAY OF NEUROTROPHIC

ACTIVE SUBSTANCE DERIVED FROM SPINAL DORSAL HORN

OF SPARED ROOT RAT

ZHANG Yuan-yuanZENG Yuan-shanCHEN Sui-jun

（Division of Neurosciences, Department of Histology and Embryology）

GU Xiong-fei

（Department of Biochemistry, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089,China）

【Abstract】ObjectiveThe extract of spinal dorsal horn of partial deafferentation(operated side) in spared root rat was isolated and purified further to look for some neurotrophic active substance. MethodsNeurotrophic active substance was isolated and analysed by Superdex G-75 prep grade gel chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC) and cell culture, ect.ResultsPeak A eluate was obtained from the extract of spinal dorsal horn of operated side through Superdex G-75 prep grade gel chromatography and HPLC. The peak A eluate played a neurotrophic active role in promoting survival and neurite growth of dissociated neurons of chick embryonal dorsal root ganglion(DRG) in vitro. According to the analysis of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), peak A eluate presented a main protein band with a molecular weight of 60kD.ConclusionThe 60kD protein may be a neurotrophic active substance of spinal dorsal horn of operated side by the result of bioactive assay.

【Key words】Spared root preparation; Cell culture; Gel chromatography; High performance liquid chromatography; Neurotrophic active substance

1958年，Liu和Chambers^［1］创建了备用根动物模型，即切断成年猫脊髓一侧数条背根，但保留其中的一条背根(备用根)，并观察到备用根初级传入纤维能够在脊髓后角发生侧支出芽。因此首次发现成年哺乳动物中枢神经系统(CNS)在损伤后具有修复能力，从而提出了CNS具有可塑性的新概念。随后几十年，许多学者的研究都证实在成年哺乳动物部分去除传入纤维支配的脊髓内来自于背根的初级传入纤维可发生侧支出芽，并重建突触联系^［2～4］。据最近的研究发现^［5］，部分去传入纤维支配的脊髓后角组织含有神经营养活性物质，其分子量约在40～78 kD之间。因此推测这可能是引起初级传入纤维在脊髓后角内侧支出芽和突触重建的重要因素之一。但现在还不清楚备用根大鼠脊髓后角组织提取液40～78 kD的蛋白质组分中究竟是哪种分子量蛋白质具有神经营养活性作用?为了寻找这种物质，本实验在以上研究的基础上，利用Superdex G-75 prep grade凝胶层析以及高效液相色谱(HPLC)等蛋白质分离纯化技术，进一步分离纯化备用根大鼠背根切断侧脊髓后角组织提取液，以期获得某种神经营养活性物质，为深入探讨引起脊髓可塑性变化的分子基础提供实验依据，这将有助于了解在神经系统发育过程中某一神经通路建立所涉及的化学因子以及损伤后的修复机制。

材料和方法

1.备用根模型动物的制备

用体重为180～200 g的雄性SD大鼠100只，按前述方法进行备用根模型手术^［5］，即切除左侧L1～L3、L5和L6背根和背根节(DRG)，保留L4背根(备用背根)。术后动物存活5d。

2.脊髓后角组织提取液的制备

用击毙法处死术后存活5d的备用根大鼠，以脊髓横断面中央管作为前、后角的分界线，分别切取L1～L6脊髓节段手术侧和非手术侧脊髓后角组织。每300 mg的后角组织加入2 ml 10 mmol/L PBS(pH7.0)，在高速匀浆器内匀浆，5 000 r/min，匀浆3 s；离心10 min，1 200 r/min。收集上清液，即为手术侧和非手术侧脊髓后角组织提取液，用于蛋白质浓度测定、生物活性检测、凝胶层析和电泳分析。

3. Superdex G-75 prep grade凝胶层析

将Superdex G-75 prep grade(Pharmasia产品)装入洁净的层析柱(70 cm×1 cm)，用洗脱液10 mmol/L PBS(pH7.0)平衡层析柱48h后，加入2 ml的备用根大鼠手术侧脊髓后角组织提取液(样品液)，然后用10 mmol/L PBS洗脱。流速每管2 ml，15 min，4℃。分部收集各峰值处的洗脱液，经滤膜超滤浓缩后，用于蛋白质浓度测定、生物活性检测、HPLC层析和电泳分析。

4. HPLC层析

将凝胶层析得到的具有生物活性的洗脱液(活性峰)，加入到HPLC仪(6000 A型，Waters Millipore公司，USA)的蛋白质PAK 200SW型柱(300mm×8mm)中，上样量为300μl。洗脱液为10 mmol/L PBS(pH7.0)，柱温18℃，洗脱液速度为0.2 ml/min。紫外检测器441的检测波长为280 nm，数据处理系统为WDL-95色谱工作站(国家色谱研究中心)。按洗脱峰收集各洗脱液，然后冷冻干燥，用于蛋白质浓度测定、生物活性检测和电泳分析。

5.考马斯亮蓝法测定样品液的蛋白质浓度

配制5种标准浓度的牛血清白蛋白(单位：mg/L)10、20、30、40和50，以空白管调零。考马斯亮蓝G-250显色。在595nm波长下测出A值，绘制标准曲线^［6］。各级样品液浓度可从标准曲线上查知。

6.脊髓后角组织提取液各级样品液的生物活性检测

6.1制备脊髓后角组织提取液各级样品液的培养液：以各级最低蛋白质浓度的样品液为基准，将同级的样品液稀释成相同的蛋白质浓度。然后将样品液用针头滤器过滤除菌后，按照1份样品液，加入2份培养液的比例进行稀释。培养液为DMEM，其中补加1／3胎牛血清、葡萄糖1.5 g/L、NaHCO₃ 2.2 g/L、青霉素10⁵ μg/L和链霉素0.1 g/L。按同样方法将10 mmol/L PBS代替上述样品液制备对照组培养液。

6.2鸡胚DRG悬滴培养法检测样品液的生物活性：从胚龄9 d的鸡胚取出腰段DRG，应用悬滴培养法，用手术侧和非手术侧脊髓后角组织提取液的培养液分别培养鸡胚DRG。每个DRG加入培养液40μl，在37℃恒温培养箱内培养。培养48h，将盖玻片培养物(涂有胶原基质的盖玻片及附着在基质上培养的DRG)放入10%中性福尔马林溶液内，固定1h，然后用1%甲苯胺蓝溶液染色^［7］。在光镜下先观察DRG神经突起生长晕的生长情况，并用目镜方格测试系统对其中的神经突起进行半定量计数^［8，9］，即神经突起的分支越多而长，则与测试系统上的横、竖测试线的交叉点数就越多，反之则少。对各组所得数据均进行两样本均数t检验，求出P值。

6.3鸡胚DRG分离细胞盖玻片培养法检测样品液生物活性：分离9 d龄鸡胚DRG细胞，制成细胞悬液，接种在涂有多聚赖氨酸的盖玻片上，每片约含3×10⁴细胞。此盖玻片放在培养皿内，每皿分别加入含凝胶柱层析洗脱液或HPLC层析洗脱液的培养液1.5 ml。置37℃ CO₂培养箱培养48h，用2.5%戊二醛固定。在倒置相差显微镜下，以涂有多聚赖氨酸的边缘为起点，按“Z”字形轨迹上、下移动盖玻片，计数每组5个盖玻片上存活的神经元数目和长突起的神经元(神经突起长度大于其胞体直径者)总数。对各组所得数据均进行两样本均数t检验求P值。

7.SDS-PAGE和蛋白质分子量测定

将备用根大鼠手术侧脊髓后角组织提取液和具有生物活性的凝胶柱层析洗脱液及HPLC层析洗脱液进行SDS-PAGE。电泳分离胶浓度为12%，浓缩胶<