【摘要】目的研究bax基因在正常小鼠睾丸中的表达、定位及隐睾所导致的改变。方法以Western-blotting印迹法从蛋白水平检测bax基因在正常小鼠睾丸及实验性隐睾中的表达、变化；原位杂交技术及Northern杂交法从mRNA水平检测bax基因在小鼠生精上皮中的定位及隐睾所导致的改变。结果bax基因在正常小鼠睾丸中有弱表达，实验性隐睾导致其表达明显增强，表达细胞主要为精母细胞、精原细胞和精子细胞，支持细胞和间质细胞未见表达。结论bax基因可能在生精细胞主动退化的调节中起着重要作用。

【中图分类号】Q343.1；Q492.4【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)04-335

THE STUDY OF bax GENE EXPRESSION IN NORMAL MOUSE

TESTES AND EXPERIMENTAL CRYPTORCHIDISM

XU jianXU Zeng-luQIAN Xiao-jingXU Yuan-yuan

（Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100005,China）

【Abstract】ObjectiveTo investigate bax gene expression and distribution in mouse testes and experimental cryptorchidism. MethodsWestern-blotting, in situ hybridizaton and Northern hybridization were used. Resultsbax gene showed low level expression in normal mouse testes. Experimental cryptorchidism induced Bax protein and bax mRNA transcription increased obviously. bax gene expressed mainly in spermatocytes,spermatogonia and spermatids. bax gene expression in both Sertoli cells and Leydig cells was negative. Conclusionbax gene may play an important role in germ cells degeneration.

【Key words】bax gene; Germ cells; Degeneration; Mouse

生精过程中存在着大量的生精细胞正常的主动退化，但其机制尤其是分子机制仍不清楚。近年，国外一些研究者开始将这种主动退化与细胞凋亡联系在一起。越来越多的证据证明，生精细胞中存在着凋亡，凋亡可能是生精细胞主动退化的重要机制^［1，2］。bcl-2基因是1984年Tsujimoto等^［3］从滤泡性B淋巴细胞瘤中分离出来的一种癌基因，大量的证据表明它是细胞凋亡的重要抑制基因。随着研究的深入，不断发现一些与bcl-2有不同程度同源性的基因，它们都有高度保守的BH1和BH2功能区，可通过彼此的相互作用来调节细胞凋亡。这些基因统称bcl-2基因家族。其中bax是第一个被分离的bcl-2同源基因，主要编码21kD的膜蛋白，与bcl-2基因功能相反，它促进细胞凋亡。Bax蛋白可以自身形成同源二聚体，也能与Bcl-2形成异源二聚体^［4］。但是，bax基因在正常小鼠睾丸中是否表达，对生精细胞的凋亡是否有调控作用，有什么样的调控作用，目前难以定论。本实验采用隐睾建立生精细胞凋亡的模型，从蛋白及mRNA水平检测bax基因在小鼠生精上皮中的表达、定位及隐睾所导致的改变。

材料和方法

1.动物来源及动物模型的建立

中国医学科学院动物所提供的8～10周(26～30 g)健康雄性昆明小鼠。3%戊巴比妥腹腔注射麻醉(1 ml/kg)，将阴囊中的睾丸轻轻推入腹腔，缝合单侧腹股沟管，使小鼠睾丸不能从腹腔下降至阴囊，术后3、6、8 d取材，每组动物12～15只。

2试剂

兔抗小鼠Bax多抗、生物素化的山羊抗兔抗体、辣根酶标记链抗生物素(Santa Cruz Biotechnology公司，购于北京中山生物技术有限公司)，山羊血清(Vector Laboratories, Burlingame)，琼脂糖(agrose)、蛋白酶K(protein kinase)、Trizol(Sigma公司)，随机引物标记试剂盒(prime-a-gene-labeling system, Promega公司)，地高辛DNA标记和检测试剂盒(DIG DNA Labeling and Detection kit Boehringer Mannheim公司)，含小鼠bax基因cDNA片段的重组质粒由美国Washington University,Stanley J. Korsmeyer博士惠赠。

3.Western-blotting印迹法^［5］

新鲜睾丸组织在冰上剪碎，加入适量新配蛋白提取液(脲0.3g，SDS 0.05g，DTT 0.125g，加去离子水5 ml溶解)，振荡器上振荡10 min，加NP-40至终浓度10%，振荡10 min，15 000 r/min，4℃ 20 min，取上清。考马斯亮蓝染色法测定蛋白含量。SDS-PAGE电泳，加样量25 μg，电流20～30 mA。剪大小完全吻合或稍小的硝酸纤维素膜及滤纸，作好标记，电转移过夜，电流65 mA／cm²。硝酸纤维素膜于1×丽春红S染液中染色15～30 min，蒸馏水中漂洗至显带清楚，切下相应部位的硝酸纤维素膜，蒸馏水中漂洗，1% BSA封闭液中室温封闭5 h。1∶500封闭液稀释的兔抗小鼠Bax多抗4℃过夜，PBS洗3次，10 min／次，1∶1 000封闭液稀释的生物素化的山羊抗兔抗体室温孵育2 h，PBS洗3次，10 min／次，1∶1 000PBS稀释的辣根酶标记链抗生物素室温孵育2h，PBS洗3次，10 min／次，新鲜配置的DAB显色液中显色，TE终止，摄片。

4.石蜡组织切片原位杂交及统计学分析

含小鼠bax基因cDNA片段的重组质粒用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α菌株，碱裂解法进行质粒DNA的大量制备，PEG法纯化，限制性内切酶EcoRI消化，低熔点琼脂糖回收cDNA片段，测定A₂₆₀和A₂₈₀值，计算DNA浓度。bax基因cDNA探针用地高辛试剂盒标记和检测。睾丸组织4%中性福尔马林固定24h，常规石蜡包埋。6μm的石蜡组织切片以0.04%DEPC水裱贴于圆玻片上，52℃过夜烤干。新鲜二甲苯37℃ 30 min，室温10 min，梯度酒精脱水，PBS洗2次，5 min／次，新配的0.3% Tritonx-100 10 min,PBS洗2次，5 min／次，蛋白酶K(1 mg/L)37℃ 30 min，冷PBS洗3次，5 min／次，0.25%乙酸酐室温10 min，PBS洗2次，5 min／次。余下步骤按常规原位杂交方法操作，终止显色后梯度酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片，镜检并摄片。对照：以杂交液中免去探针作阴性对照。利用Pharmacia LKB Ultroscan XL激光密度扫描分析系统，对阳性杂交信号单位面积平均灰度进行半定量扫描分析，结果以“学生”NK检验(Student Newman-Keuls，SNK)进行统计学分析，P＜0.05，为差异显著。

5.组织总RNA提取

新鲜或液氮中保存的睾丸组织在冰上剪碎，加适量Trizol试剂充分匀浆，吸管反复吹打均匀，室温放置5 min。每ml Trizol加入0.2 ml氯仿，振荡混匀15 s，室温放置5 min，4℃，10 000 r/min，15 min，转移上清，加入0.5 ml异丙醇，振荡混匀，室温放置10 min，4 ℃，10 000 r/min，15 min，弃上清，沉淀以75%乙醇洗涤后晾干，溶于50 μl DEPC水中。

6.Northern杂交

bax基因cDNA探针用α-³²P dCTP，随机引物标记试剂盒(prime-a-gene-labeling system, Prom-ega公司)标记，Sephadex G-50柱层析法纯化，测定探针比放射活性大于1×10⁸ cpm／μg，DNA。组织总RNA用甲醛变性的1% 琼脂糖凝胶分离，每个泳道30 μg，总RNA。DEPC水淋洗凝胶数次，50 mmol/L的NaOH处理20 min以水解RNA，无RNA酶的水淋洗数次，20×SSC浸泡凝胶45 min，用20×SSC转膜过夜。转移结束后，6×SSC漂洗，晾干，紫外交联。用Express HybTM Hybridization Solution(Clontech 公司)进行常规Northern杂交，-70℃曝光72 h。以β-actin作内对照。

结果

1.bax基因蛋白表达水平的变化

Western-blotting印迹结果显示：正常小鼠睾丸组织中可见较弱的阳性印迹带，说明Bax蛋白在正常小鼠睾丸中有弱表达，术后3d无显著变化，术后6～8d的印迹带阳性信号逐渐增强(图1)，可见Bax蛋白表达在逐渐升高，呈上调趋势。

2.bax基因mRNA转录水平的变化

图1Bax蛋白Western-blotting印迹

Fig.1 Western-blotting analysis of Bax protein

2.1原位杂交结果及统计学分析：正常小鼠睾丸的组织切片中，生精上皮的各级生精细胞包括精原细胞、精母细胞及精子细胞均出现蓝色阳性染色，但信号较弱(图2A)，表明bax基因在正常生精细胞中mRNA转录水平较低，支持细胞和间质细胞中未见阳性信号。隐睾术后3 d，信号开始增强，但灰度扫描无显著差异；6、8d，各级生精细胞呈现明显的阳性染色(图2B)，灰度扫描显示与正常及术后3d均有显著差异，其中8d信号最强，与6d也有显著差异(附表)，表明bax基因在隐睾术后的mRNA转录水平有明显提高。阴性对照未见阳性染色(图2C)。

图2组织切片bax cDNA原位杂交×200

Fig.2 Distribution of bax mRNA in mouse testes, as detect