【摘要】目的分析探讨人乳腺癌细胞中cyclinD1的表达受到反义RNA抑制后，细胞增殖能力的变化以及cyclinE,CDK2和p21^cip1(cip1／waf1／sdi1)基因表达受到的影响。方法将表达cyclinD1反义RNA的重组质粒转入人乳腺癌细胞，由此抑制细胞中cyclinD1的表达，然后分析细胞生长速率和各时相细胞分布比例的变化，并通过Northern blot分析有关基因的表达水平。结果cyclinD1表达受到抑制的细胞与对照相比，细胞增殖速率明显下降，培养至第6d时，生长抑制率为54%。细胞周期各时相的分布比例也有较大的变化，G1期细胞比例上升，而S期及G2／M期细胞比例下降。cyclinE和CDK2的mRNA水平显示出有不同程度的下降，而p21^cip1的表达无明显变化。结论cyclinD1表达的抑制可明显减弱人乳腺癌细胞的异常增殖，同时表明同为细胞周期调控基因的cyclinE和CDK2的表达与cyclinD1的表达密切相关，而p21^cip1的表达不受cyclinD1的影响。

【中图分类号】Q28；R329【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)03-221

INHIBITION EFFECT OF cyclinD1 ON CELL PROLIFERATION AND

TRANSCRIPTION OF cyclinE, CDK2 AND p21^cip1

IN HUMAN BREAST CANCER CELL LINE

SANG Jian-liYE Ying-jiangWANG Yong-chao

Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology, College of Life Science,Beijing Normal University, Beijing100875, China

General Surgerg,the Second Hospital,Beijing Medical University,Beijing100044, China

【Abstract】ObjectiveTo study the changes of cell proliferation and the effects on transcription of cyclinE, CDK2 and p21^cip1(cip／waf1／sdil) when cyclinD1 was inhibited by antisense RNA in human breast cancer(Bcap-37). MethodsThe recombinant vector expressing cyclinD1 antisense RNA was transfected into the cells to inhibite the expression of cyclinD1, then the rate of cell proliferation and distribution of different phase of cell cycles were measured. At the same time the transcription of cyclinE, CDK2 and p21^cip1 were analyzed by Northern blot.ResultsAs comparing the cells in which cyclin D1 was inhibited with control cells, the cell proliferation reduced markedly, the radio of growth inhibition was about 54% at the sixth day in assay of cell growth. The changes of distribution of phases in cell cycle were oberved. The proportion of cells in G1 phase increased while the proportion of cells in S and G2／M phase decreased. The levels of cyclinE and CDK2 mRNA fell to a certain extent and expression of p21^cip1 did not show apparent change.ConclusionThe inhibition of cyclinD1 lessens abnormal cell proliferation of human breast cancer. The expressions of cyclinE and CDK2 as the genes in cell cycle control have close relationship with that of cyclinD1 while the expression of p21^cip1 is not affected by cyclinD1.

【Key words】Breast cancer; Cell proliferation; cyclinD1; CDK2; p21^cip1自从cyclin和CDK基因被发现后，对于它们在细胞周期调控中的作用已有大量深入的研究。现已证实，细胞周期的进程受到cyclin和CDK基因的调控，当cyclin与CDK的蛋白质产物形成有活性的蛋白激酶复合体时，便可启动细胞周期并且促进周期中不同时相的转换^［1］。随着对细胞周期调控的研究，又发现了CDK抑制因子(CKI)的存在，这些因子能够与cyclin／CDK蛋白激酶复合体结合而抑制酶的活性。p21^cip1是CKI中发现较早、作用较广泛的一种^［2］。在对细胞周期调控机制研究的同时，人们意识到调控细胞周期的基因有可能在肿瘤细胞的发生与发展中起重要作用，正因为如此，近年来对于cyclin、CDK和p21^cip1在肿瘤细胞中异常表达的研究受到广泛重视^［3—6］。本研究中，利用cyclinD1反义RNA抑制此基因的表达，观察分析了cyclinD1受到抑制后，对人乳腺癌细胞增殖的影响，以及对同属于细胞周期调控基因的cyclinE、CDK2和p21^cip1表达的影响。由此，不仅进一步探讨了cyclinD1与乳腺癌异常增殖的相关性，同时，分析了cyclinD1与其他细胞周期调控基因在表达上的关联。

材料和方法

1.细胞培养

人乳腺癌细胞系Bcap-37来自北京医科大学第二附属医院妇科肿瘤研究所。细胞培养基为PRMI1640加10%小牛血清，在37℃含5%CO₂培养箱中培养。

2.cyclinD1反义RNA真核细胞表达载体的构建及细胞转染

本研究中所用的cyclinD1基因cDNA、CDK2基因cDNA由美国Cold Spring Harbor实验室的David Beach博士惠赠，cyclinE基因cDNA由美国Scripps研究所的Steve Reed博士惠赠，p21^cip1基因cDNA由中国科学院水生生物研究所的桂建芳博士惠赠，真核细胞表达载体pXJ41-neo由新加坡国立大学王跃博士惠赠。用限制性内切酶E.CoRI将cyclinD1 cDNA从原质粒(puc118)上切下，并分离纯化，同时用相同的酶切表达载体pXJ41-neo，然后将cyclinD1 cDNA片段连接到表达载体中，利用cyclinD1序列和载体多克隆位点中HindIII酶切位点，筛选出表达反义RNA的重组质粒(图1)。细胞转染采用磷酸钙共沉淀法。

3.细胞生长曲线测定

取对数生长期细胞，将其密度稀释成10⁴个／ml，于6孔板中培养，每24h取1次样，每次每个样品取3个孔的细胞，每个孔的细胞密度计数3次，计数后取平均数，连续测定6次样，并绘制成曲线。

4.流式细胞光度术分析

取对数生长期细胞，用75%乙醇固定过夜，PBS洗2次后加入RNaseA(100mg/L)37℃保温30～60min，用碘化丙啶(prpidium iodide,PI 50mg/L)在冰上避光染色30min，细胞经尼龙网过滤后，在自动流式细胞分析仪上测定。

5.Northern blot分析

采用硫氰酸胍-酚-氯仿法提取细胞总RNA^［7］，在1.2%的甲醛变性琼脂糖凝胶中电泳，首先配制的凝胶在80V电压下预电泳5min，点样后将电压调至56V，电泳约1.5h时，将前后电极液适当混合，约3h结束电泳。在紫外光下迅速观察胶中各样的18S和28S rRNA带，判断RNA的完整性和样品量的均一性，并作为各样品的内对照。杂交探针是体外转录的各基因片段的反义RNA，并用含³²P的UTP标记。凝胶中的RNA通过真空转移装置转移到尼龙膜上，80℃烤膜2h，然后进行预杂交，杂交、洗膜与曝光。整个过程各步骤所使用的试剂和具体操作均参考《分子克隆实验指南》^［8］中所提供的方法。

图1cyclinD1反义RNA真核表达载体

Fig.1Eukaryotic expression vector of cyclinD1 antisense RNA

结果

1.表达cyclinD1反义RNA人乳腺癌细胞模型的建立

采用磷酸钙共沉淀法，分别将表达cyclinD1反义RNA的重组质粒和空载体质粒转入人乳腺癌细胞Bcap-37中，将被转染的细胞培养于含G418(200mg/L)的培养基中，经过筛选得到阳性细胞克隆。然后利用原位杂交方法对阳性细胞克隆做进一步的鉴定，首先利用地高辛RNA标记试剂盒，在T₇RNA聚合酶的作用下，转录出带有地高辛标记的cyclinD1正义链RNA作为探针，对筛选出的G418抗性细胞进行原位杂交检测，原位杂交主要包括细胞的固定，预处理，预杂交，杂交，洗片与显色反应等过程，具体操作按照《原位杂交》^［9］中的方法进行，结果显示筛选出的细胞呈阳性显色反应，表明细胞中有cyclinD1反义RNA表达，而对照细胞为阴性显色反应(图2)。这样建立了表达cyclinD1反义RNA的细胞模型，可用于研究cyclinD1表达受到抑制后，人乳腺癌细胞增殖能力的变化，以及cyclinE，CDK2和p21^cip1在转录上是否受到影响。

图2利用原位杂交鉴定表达cyclinD1反义RNA的细胞×400

a.表达cyclinD1反义RNA的细胞b.对照细胞

Fig.2 Detection of cells expressing cyclinD1 antisense RNA by in situ hybrydization×400

a,cells expressing cyclinD1 antisense RNA;b,control cells

2.抑制cyclinD1表达对人乳腺癌细胞<