【摘要】目的研究Ⅳ型胶原、层粘连蛋白(laminin, LN)和间质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)在不同年龄小鼠卵巢中的分布和变化模式。方法利用生物素-抗生物素蛋白间接免疫荧光方法，从蛋白水平观察Ⅳ型胶原和LN的分布和变化；利用地高辛标记的Ⅳ型胶原和MMP-2基因探针进行原位杂交，从mRNA水平观察Ⅳ型胶原和MMP-2的分布和变化。结果出生5d小鼠卵巢的卵泡基膜和卵巢表面上皮(ovarian surface epithelium, OSE)基膜处已有少量Ⅳ型胶原和LN分布，基质细胞和OSE中也有分布。Ⅳ型胶原和MMP-2的mRNA在基质细胞和OSE有表达。发育期小鼠卵巢中卵泡基膜和OSE基膜中Ⅳ型胶原和LN的含量随年龄的增加而呈增加趋势，分布也趋于连续。颗粒细胞、膜细胞、OSE中都有Ⅳ型胶原和LN分布，也有Ⅳ型胶原和MMP-2 mRNA的表达，其表达水平明显比5d时高。成熟期小鼠卵巢Ⅳ型胶原和LN的含量较高。12个月的小鼠卵巢已开始退化，基膜细胞外间质(extracellular matrix,ECM)的数量减少，MMP-2 mRNA的表达量无明显变化。结论Ⅳ型胶原和LN在小鼠卵巢发育过程中含量和分布发生着动态变化，可能对卵泡发育起重要作用。

【中图分类号】R322.6⁺5，R329.2⁺4【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)03-231

SYNTHESIS AND DISTRIBUTION OF TYPE Ⅳ COLLAGEN, MATRIX

METALLOPROTEINASE AND LAMININ IN MOUSE OVARIES

QIAN Xiao-jing, XU Zeng-lu, XU Jian, XU Yuan-yuan

(Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing100005, China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the distribution of type Ⅳ collagen and LN and the expression of type Ⅳ collagen and MMP-2 genes. MethodsBiotin-avidin DCS system indirect immunofluorescence technique, in situ hybridization with diglabeling type Ⅳ collagen and MMP-2 cDNA probe were used. ResultsIn the ovary of 5-day-old neonatal mouse, a small amount of type Ⅳ collagen and LN fluorescence was seen in the basement membrane of follicle and OSE. The expression of type Ⅳ collagen and MMP-2 was observed inside OSE and stromal cells. In 15day to 2 month old mouse ovaries, the contents of ECM components increased with advancing age, and the distribution of basement membrane componets were smoothly than before. The mRNA expressions of type Ⅳ collagen and MMP-2 was markedly increased during this peroid. OSE, granulosa and thecal cells were the cells, which contributed to the synthesis of those ECM components and MMP-2. In 2 to 6 month mouse ovaries, the amount of basement membrane ECM components did not change much, and maintain about the same level. In 12-month-old mouse ovary, the contents of the basement membrane ECM components decreased.ConclusionWe suggest that the type Ⅳ collagen and LN of ovary may play important roles in the process of follicle development.

【Key words】Type Ⅳ collagen; LN; MMP-2; Ovary

细胞外间质包括多种具有生物活性的大分子，它们在许多生理和病理过程中发挥重要作用。卵巢中有丰富的ECM，其中基膜就是由Ⅳ型胶原，层粘连蛋白，巢蛋白／制动素和硫酸乙酰肝素等多种ECM成分构成的^［1］，但这些成分在卵泡发育中所起的作用目前尚不清楚。本实验选取小鼠作为实验动物，采用免疫细胞化学，组织化学和分子生物学等技术方法，研究不同年龄阶段的小鼠卵巢中Ⅳ型胶原，LN以及MMP-2的分布和变化规律，探讨这些ECM成分和蛋白水解酶对卵泡的发育过程所起的作用。为卵泡发育提供理论基础，为女性计划生育研究提供科学依据。

材料和方法

1.实验动物

由中国医学科学院动物所提供健康5d和15d，1、2、3、6和12个月雌性昆明小鼠，断颈处死后取卵巢。一侧用中性福尔马林固定液固定24h后，常规石蜡包埋、切片，片厚6μm。另一侧用OCT包埋，液氮迅速冷冻，组织块用恒冷箱切片机切片，片厚8～10μm。

2.试剂

兔抗小鼠Ⅳ型胶原抗体和兔抗小鼠LN抗体，由北京医科大学细胞生物室提供。生物素化山羊抗兔IgG和荧光素抗生物素蛋白DCS购于北京中山生物技术有限公司。地高辛DNA标记和检测试剂盒购于德国Boehringer Mannheim。含人Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链cDNA插入片段的重组质粒和含人MMP-2 cDNA插入片段的重组质粒，均由芬兰Tuomo Karttunen教授和Helena Autio-Harmainen教授惠赠。

3.荧光素-抗生物素蛋白间接免疫荧光染色

冰冻切片室温干燥后，在组织上滴加用PBS稀释的正常山羊血清，4℃孵育20min。分别加兔抗小鼠Ⅳ型胶原抗体和兔抗小鼠LN抗体，4℃孵育过夜。对照片此步以山羊血清代替第一抗体。冷PBS冲洗。加入生物素化的山羊抗兔IgG,4℃孵育1h。冷PBS冲洗。加入以碳酸氢钠缓冲液稀释的荧光素-抗生物素蛋白DCS，4℃孵育1h。冷PBS冲洗。用含PBS和对苯基二胺(P-phenylenediamine,PPd)的甘油做介质封片。标本在Olympus反射式荧光显微镜下观察、摄片。

4.石蜡组织切片原位杂交及统计学处理

含人Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链cDNA和人MMP-2 cDNA片段的重组质粒分别用磷酸钙法转化大肠杆菌DH5α菌株，碱裂解法进行质粒DNA的大量制备，PEG法纯化，限制性内切酶消化，低熔点琼脂糖回收cDNA片段，测定OD₂₆₀和OD₂₈₀值，计算DNA浓度。人与小鼠的Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链以及MMP-2均有很高同源性^［2，3］。Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链cDNA和MMP-2 cDNA探针根据Boringer Mannheim公司推荐的标准程序进行cDNA探针非放射性标记及免疫检测。

石蜡组织切片以0.04% DEPC水裱贴于圆玻片上，52℃过夜烤干。新鲜二甲苯37℃，30min，室温10min，梯度酒精脱水，PBS冲洗。新配的0.3% Triton X-100 10min,PBS冲洗。蛋白酶 K(1mg/L)37℃ 30min，冷PBS冲洗。0.25%乙酸酐室温10min，PBS冲洗。余下步骤按常规原位杂交方法^［4］操作，终止显色后梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片，镜检并摄片。对照：以杂交液中免去探针作阴性对照。

利用Pharmacia LKB Ultroscan XL激光密度扫描系统对照片做半定量灰度扫描，以其单位面积平均灰度值作为mRNA表达量的参数，并将结果以方差检验和Student Newman-Keuls(SNK)检验进行统计学分析，所有数据都以均值±标准误差(±s)表示，P＜0.05为差异显著。

结果

1.间接免疫荧光染色观察结果

1.1Ⅳ型胶原(图1A)：卵巢整体的荧光强度从5d到2个月一直在增加，进入性成熟期后荧光强度保持稳定，至12个月时下降。5d时原始卵泡外已有绿色荧光环绕，初级卵泡的基膜荧光染色弱且不完整。随年龄增加，各级卵泡基膜荧光逐渐增强，形成完整、光滑的基膜。5d时卵巢基质细胞和OSE有弱荧光，颗粒细胞和卵母细胞未显示荧光。15d膜细胞和颗粒细胞内有较弱绿色荧光出现。从15d到2个月卵巢中膜细胞的荧光一直在增加，其幅度较大。进入性成熟期后，膜细胞荧光强度保持较高水平，变化幅度不大，12个月时减弱。颗粒细胞变化不明显。

1.2层粘连蛋白(图1B)：层粘连蛋白间接免疫荧光分布与变化趋势基本与Ⅳ型胶原相似，颗粒细胞之间的荧光比Ⅳ型胶原稍强，部分呈点状分布。

1.3阴性对照片未见绿色荧光。

图3不同年龄小鼠卵巢Ⅳ型胶原原位杂交统计分析图

Fig.3Densitometric quantification analysis of in

situ hybridization of type Ⅳ collagen α1(Ⅳ) mRNA

expression in mouse ovaries of different age

图4不同年龄小鼠卵巢MMP-2 mRNA原位杂交统计分析图

Fig.4Densitometric quantification analysis of in situ hybridization of

MMP-2 mRNA expression in mouse ovaries of different age

2.cDNA探针的鉴定

2.1含Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链cDNA探针的质粒，用Bam HI和Hind Ⅲ进行限制性酶切，经琼脂糖凝胶电泳，紫外灯观察鉴定，酶切片段长度为0.9kb，与预期相符。

2.