【摘要】目的利用自行构建的BHK-hGDNF基因工程细胞，研究GDNF是否具有促进大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞分化的作用。方法从人胎儿脑组织中提取总RNA，用RT-PCR的方法克隆人GDNF基因；利用Lipofecamine将构建的真核表达载体pTARGET／hGDNF(±)转染BHK-21细胞，在含有G418的选择培养基中筛选出稳定表达人GDNF的BHK-hGDNF基因工程细胞。用免疫组织化学的方法检测BHK-hGDNF基因工程细胞中人GDNF的表达。并且用BHK-hGDNF基因工程细胞培养的上清液培养PC12细胞，观察GDNF是否具有促进大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞分化作用。结果构建的正向和反向真核表达载体pTARGET／hGDNF(±)的酶解消化和测序结果正确；用正向真核表达载体pTARGET／hGDNF(+)转染BHK-21细胞后免疫组织化学的结果证明BHK-hGDNF细胞能够表达人GDNF；BHK-hGDNF基因工程细胞培养上清液可以促进PC12细胞分化。结论构建的BHK-hGDNF基因工程细胞中表达的人GDNF可以促进PC12细胞分化。

【中图分类号】Q593.2；R329.2⁺8；R329.2⁺1【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)03-246

THE HUMAN GDNF STABLE EXPRESSION IN ENGINEERED

CELLS INDUCED DIFFERENTIATION OF PC12 CELLS

JIAO Jian-weiTIAN Jing-shengQI Ya-huiHE Cui-zhenSHANG Yong-LeiLIN Jia-you

（Department of Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100005，China）

（Beijing Institute of Neuroscience, Capital University of Medical Sciences, Beijing100054,China）

【Abstract】ObjectiveTo explore differentiation of PC12 cells by using stable expression engineered BHK-hGDNF cells. MethodsWe obtained GDNF DNA from human fetal brain tissues by RT-PCR and two mammalian expression vectors were constructed. The two mammalian expression vectors pTARGET／hGDNF (±) were transfected into BHK-21 cells mediated by lipofecamine. The GDNF stable expression in BHK-GDNF cells was detected by immunohistochemical staining method. To detect if GDNF can induce differentiation of PC12 cells, the PC12 cells were cultured in the supernatant of BHK-GDNF cells culture medium. ResultsIdentifications of pTARGET／hGDNF(±) were confirmed by digestion of endonuclease and sequence analysis; The immunohistochemical staining positive cells were observed in BHK-21 cells that were transfected with pTARGET／hGDNF(+). The PC12 cell can be induced to differentiate to neuronal cell with culture supernatant of BHK-GDNF cells. ConclusionsThe human GDNF can be expressed by constructed BHK-GDNF engineered cells, and human GDNF is able to induce the differentiation of PC12 cells to neuronal cells.

【Key words】Glial cell line-derived neurotrophic factor; Genetic engineered cells; Cells differentiation

神经营养因子是一类能够促进神经细胞存活、生长和分化的蛋白质或多肽，在神经系统的发育、生长、损伤和修复等过程中发挥重要作用。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)是1993年Lin等^［1］首先在鼠胶质细胞系B49中发现的一种具有特异地促进中脑多巴胺能神经元生存的神经营养因子。人和鼠GDNF分子有93%～95%的同源性。由于GDNF含有的7个保守的半胱氨酸残基与转化生长因子-β(TGF-β)的半胱氨酸残基位置一致，因此GDNF属于TGF-β超家族成员之一。人GDNF基因定位于染色体5p12-p13.1^［2］，其成熟蛋白含有134个氨基酸残基。体内、外实验表明：GDNF具有很强的促进中脑多巴胺能神经元、中枢胆碱能神经元、脊髓运动神经元交感、副交感感觉神经元的存活作用^［3～7］。目前，国外应用GDNF治疗帕金森病已经进入了临床Ⅲ期阶段^［8］。在本研究中，我们从人胎儿脑组织中提取总RNA利用RT-PCR的方法克隆了人GDNF的基因，构建了真核表达载体；并且用构建pTARGET／hGDNF(±)真核表达载体分别转染BHK-21细胞，筛选出稳定表达人GDNF的BHK-hGDNF基因工程细胞；探讨GDNF对大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12的分化作用。

图1pTARGET／hGDNF(±)表达载体的构建

Fig.1Construction of pTARGET／hGDNF(±) expression vector

材料和方法

1.人GDNF基因的克隆、真核表达载体的构建与鉴定

脑组织来源于因故终止妊娠的胎儿(5个月)(宣武医院妇产科)。取100mg胎脑组织采用异硫氰酸胍一步法提取脑组织总RNA^［9］。RNA进行琼脂糖甲醛变性电泳，如果28s和18s清晰无降解则进行反转录反应。在反转录反应中以OligdT_15-18(Promega)为引物合成cDNA第1链。然后用cDNA为模板，以GDNF上游、下游引物(合成于上海生物工程公司)进行PCR反应(上游引物：5’gctcgag atg aag tta tgg gat gtc gt 3',下游引物：5’cggatcct cag ata cat cca cac ctt 3')。 PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃ 45s,58℃ 1min，72℃ 1.5min，35个循环，72℃延伸5min。PCR产物在1.8%琼脂糖凝胶电泳中分析结果。用玻璃奶(博大公司)回收DNA片段约为560bp，克隆入pTARGET(Promega)真核表达载体中，经IPTG诱导蓝白菌落筛选后获得正向和反向pTARGET／hGDNF(±)两种克隆(图1)。用酶切和测序方法对克隆的基因进行鉴定。

2.用pTARGET／hGDNF(±)转染BHK-21细胞

将BHK-21细胞株(由中国预防科学院病毒所吴小兵博士惠赠)在RPMI1640(Gibco／BRL),10%马血清和5%胎牛血清，37℃、5%的CO₂的条件下传代培养，以2×10⁵细胞密度接种于35mm培养皿中。将pTARGET／hGDNF(+)和pTARGET／hGDNF(-)各2μg与10μl lipofecamine(Gibco／BRL)分别用无血清RPMI1640培养液稀释至100μl，混匀后室温放置30min，将形成的DNA-liposome复合物加入0.8ml的无血清RPMI1640培养液，然后加入60%汇片的BHK-21细胞中培养5h，弃掉含有lipofecamine的原培养液，再加入完全培养液继续培养。第3d将细胞以1∶10传代并用含400mg/L G418(Gibco／BRL)的选择培养液培养1个月，挑选阳性细胞克隆。

3.用免疫组织化学法检测GDNF在BHK-21细胞中的表达

从pTARGET／hGDNF(±)转染的BHK-21细胞中，挑选出阳性细胞克隆分别在35mm培养皿中培养，待细胞长满后用D-PBS(pH7.4)漂洗2次，4%的多聚甲醛室温固定15min；然后用新配置含1%H₂O₂的D-PBS中室温孵育15min，再用D-PBS漂洗3次，用5%的山羊血清和含0.1% Triton X-100的D-PBS缓冲液在室温下孵育30min，加入1∶100的兔抗人GDNF多克隆抗体(Santa Cruz)，4℃孵育24h，D-PBS漂洗3次，加入生物素标记的羊抗兔二抗(北京中山公司)再室温孵育30min，用D-PBS漂洗3次，加入ABC复合物(北京中山公司)置室温孵育1h，再经0.05mol/L Tris-HCl(pH7.4)漂洗3次。最后用含0.5g/L二氨基联苯胺(DAB)的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(含0.0 003% H₂O₂)倒置显微镜下观察细胞显色。

4.BHK-hGDNF基因工程细胞对PC12细胞的分化作用

将转染pTARGET／hGDNF(±)的BHK-21细胞，在无G418培养液中培养48h后，收集上清待用。大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞(由首都医科大学神经生物室惠赠)在RPMI1640，10%马血清，5%胎牛血清中传代培养。将新传代PC12细胞分成2组：1组加入稳定转染pTARGET／hGDNF(+)质粒的BHK-21细胞培养上清；另1组加入稳定转染pTARGET／hGDNF(-)质粒的BHK-21细胞培养上清。隔天换液1次，连续培养1周，倒置显微镜下观察细胞形态变化。

结果

1.真核表达载体pTARGET／hGDNF(±)的酶切与测序结果

将回收的PCR产物与pTARGET真核表达载体连接。转化至JM109大肠杆菌感受态细胞中。随机挑取在LB固体培养基(含IPTG／X-gal)上的生长白色克隆。小提质粒后用EcoRI和XhoI／BamHI酶切鉴定。由于在载体多克隆位点的两侧有2个EcoRI酶切位点，人GDNF基因片段中有1个EcoRI酶切位点，因此用EcoRI酶切可以切出两条片段。另外上游引物中含有1个XhoI酶切位点，下游引物中含有1个BamHI酶切位点，因此用XhoI／BamHI酶切可以切出人GDNF基因片段(图2)。并且可以用PstI酶切鉴定插入片段的方向(图片未附)，序列测定结果与Genbank报道的序列一致。

2.真核表达载体pTARGET／hGDNF在BHK21细胞中的表达

将转染pTARGET／hGDNF(±)的BHK-21细胞在含G418的培养液中筛选培养1个月。挑选阳性细胞克隆用ABC免疫组织化学法检测GDNF的表达。结果发现：仅pTARGET／hGDNF(+)转染的BHK-21