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【中图分类号】Q523【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)03-207
ANALYSIS OF THE IL-6 EXPRESSION IN THE ANTERIOR
PITUITARY OF ADRENALECTOMIZED RATS
XU Ping-xi, LIU Hui-ling, QIU Jian-yong, XU Han-peng, JU Gong
(Institute of Neurosciences,the Fourth Military Medical University, Xi'an710032,China)
【Abstract】ObjectiveTo explore the relationship between IL-6 and an effect of neurotrophy on the nerve fibres in anterior pituitary.MethodsTo investigate the changes of IL-6 in the anterior pituitary of adrenalectomized rats,two PCR procedures,Immuno-PCR(I-PCR) and RT-PCR were modified to quantify antigen and mRNA in tiny samples respectively to supplement the morphometry,since morphoanalysis,immunocytochemistry and in situ hybridization seemed not efficient to show quantification. ResultsThe most IL6-IL stainings were found to be gathered mainly in FS cell,and the levels of both protein and mRNA of IL-6 determined by PCRs rised obviously.Meanwhile,the activation of IL-6 gene occurred within 24h after adrenalectomy. ConclusionThis study suggests that IL-6 might be involved in the regulation of the secretion of anterior pituitary in other way independent of PHA axis,such as neuro-regulation.
【Key words】Adrenalectomy; IL-6; PCR;Nerve fiber; Anterior pituitary
垂体前叶内肽能神经纤维的发现，尤其是去肾上腺后大鼠垂体前叶内肽能神经纤维的增生，揭示了它们与垂体前叶的功能联系［1］；进而为垂体前叶功能双重调节假说提供了强有力的依据。Lu和Paden等观察到去肾上腺大鼠垂体前叶内神经纤维有GAP43大量表达，表明这些神经增生至少部分由芽生所致。从理论上讲，上述变化必然涉及到神经营养因子活动。我们曾对BDNF、NGF和NT3神经生长因子作了系统的调查，均未获得相关结果。IL-6是一个多重生物学活性的细胞因子，具有神经营养作用；并且能为垂体前叶内FS细胞合成，因此它是否参与垂体前叶中的神经纤维生长的调节值得进一步研究。
IL-6在垂体前叶中的含量甚微，一般形态定量法揭示其确切变化有一定的难度。我们在形态学定位的基础上结合微量PCR法定量分析，对去肾上腺大鼠垂体前叶中IL-6表达进行动态观察，得到了满意的结果。
材料和方法
1. 动物分组及手术
成年SD雄性大鼠30只，体重200～250g，1笼养5只，自由进食，每日昼夜光照为12h/12h。在安静环境中饲养1周，随机分为正常对照1组和双侧肾上腺切除5组。后者用戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(40mg/kg)，在无菌条件下从肋脊角处摘除双侧肾上腺，术后给予生理盐水饲饮。
2. 取材
正常对照组及手术组术后1、2、3、4和5d动物在戊巴比妥钠腹腔麻醉下开胸，留取血清样品作免疫PCR测定用。然后经左心室插管至升主动脉。灌流100ml无菌生理盐水以洗净血液，取垂体前叶迅速冷冻保存，留作PCR及原位杂交用。原位杂交标本用恒冷箱切片机作冰冻连续切片，厚15μm。
3. 原位杂交法分析
根据Northemann发表的大鼠IL-6 cDNA全序列［4］，于3′端截取42bp长度的片段，并合成寡核苷酸作为探针。探针标记和检测按地高辛DNA标记与检测试剂盒(德国Boehringer Mannheim Biochemica)说明书操作。杂交的主要步骤：取出垂体切片，无酶状态下空气晾干约1h，浸入4%多聚甲醛固定20min，依次经浸洗、蛋白酶K(50mg/L)消化、4%多聚甲醛再固定、0.25%乙酸酐封闭等10余步处理后，入杂交液(探针浓度为0.1mg/L)于42℃湿盒中孵育16h，其后分别经浓度递减的系列标准枸橼酸盐溶液(SSC)漂洗，再入地高辛抗体工作液(1∶5 000)室温作用0.5h，洗涤后加入新鲜配置显色液于室温下暗处显色。镜下观察至显色适度时，浸入蒸馏水中以终止反应。最后经系列乙醇脱水、二甲苯透明、封片。
4. PCR定量分析
4.1微量免疫PCR(I-PCR)法)
4.1.1样品提取液制备：正常对照组及肾上腺切除术后4d手术组各5只，取垂体前叶置100μl的1%Triton X-100 0.05mol/L PBS(pH7.4)中，匀浆后以10kHz 5s×3超声破碎(Soniprep SANYO),离心(10000r/min)×10min，取上清紫外分光光度法定量，稀释提取液使蛋白浓度达到1g/L。
4.1.2免疫PCR操作步骤：按徐平西等［5］建立的简易免疫PCR法，将上述提取液和1 000倍稀释后的血清20μl用戊二醛直接包被在洁净0.5毫升规格的聚乙烯PCR管内壁，空白对照管以1% BSA替代；以洗涤液(1%吐温20-PBS)洗涤3次，每次3min，依次加入1∶5 000稀释度的兔抗IL-6多克隆抗体20μl(由北京军事医学科学院沈倍奋教授惠赠)，室温下孵育3h,洗涤同上；加入1∶500稀释度的生物素化羊抗兔抗体20μl(Sigma公司)，洗涤液洗涤；加入1∶500稀释度的生物素化羊抗兔抗体20μl(Sigma公司)，室温下2h，洗涤液洗涤；加入链霉卵白素-报道模板DNA复合体20μl，置室温1h，洗涤液充分洗涤，最后以无离子水洗涤2次，拍尽残液。每管加入20μl标准PCR反应液，覆盖以矿物油，盖紧小管入PCR仪。聚合反应的温度参数为起始变性(94℃×2min)；20个PCR循环：变性(94℃×30s)，退火(56℃×40s)，延长(70℃×40s)；后置延长(72℃×5min)。取管内PCR产物5μl,行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色。紫外光下摄片，扫描灰度，分析结果。
4.2RT-PCR定量分析
4.2.1引物设计：从方法3所述基因序列中，设计出欲扩增的大鼠IL-6 cDNA片段引物；此外设计3-磷酸葡萄糖脱氢酶(G3PDH)基因片段引物作为外参照系。
大鼠IL-6片段引物1：5′-GAG AAA AGA GTT GTG CAA TGG C-3′
大鼠IL-6片段引物2：5′-ACT AGG TTT GCC GAG TAG ACC-3′
扩增产物长度444bp。
大鼠G3PDH片段引物：5′-TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3′
大鼠G3PDH片段引物2：5′-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3′
扩增产物长度309bp。
4.2.2总RNA的提取、定量：将正常及术后1、2、3、4及5d处理的单个大鼠垂体前叶按RNA提取盒(GIBCO公司)说明置入100μl TRIZOL Reagent试剂，以自制杵子在0.5ml离心管中碾匀后室温中静置5min。加入20μl氯仿剧烈振荡，室温停置3min，离心(4℃ 12 000g)15min，取上清水加入50μl异丙醇，混匀，置室温10min，离心(4℃12 000g)10min，沉淀用100μl 75%乙醇洗涤，空干，以17μl DEPC处理水溶解，再加入RNase free DNase，混匀，37℃消化0.5h；然后经酸性饱和酚抽提、沉淀、干燥及EDPC处理水溶解后，于紫外分光光度计定量，将RNA样品浓度稀释成500mg/L，备用。同时作RNA电泳以检验其完整性。
4.2.3RT-PCR循环：精确吸取2μl RNA样品作模板加入标准20μl RT-PCR反应混合液(按PROMEGA公司说明书配制)，石蜡油封盖。反应参数为：反转录反应(48℃×45min)；起始变性(94℃×2min)；40个PCR循环：变性(94℃×30s)，退火(62℃×40s)，延长(68℃×40s)；后置延长(68℃×6min)。反应结束后取产物电泳、摄片。
结果
1. 原位杂交
IL-6探针对垂体前叶切片杂交的地高辛-酶显色阳性细胞主要为FS样细胞，在分布上与免疫组织化学结果相似(图1)。然而细胞的灰度分析未能反映出肾上腺切除与正常对照的组间差异(P＞0.05)。
2. PCR的量化分析
2.1免疫PCR(I-PCR)：来自10只大鼠垂体蛋白提取液图2B和血清样品图2A，用阿拉伯数字编号，序号1～5为切除肾上腺组样品，6～10为正常对照组样品。免疫PCR产物经电泳、EB染色，灰度检测结果提示血清样品中两组间的IL-6浓度无明显改变，而垂体提取液样品显示出组间差异，其中手术组的2～4号样品的IL-6增加尤为明显(图2B)。提示去除肾上腺后引起垂体前叶内IL-6含量的显著变化(图2C)。
