【摘要】目的研究胚胎小鼠下丘脑培养状态下SRIF神经元的发生。方法采用原代分离培养的方法，将胚胎小鼠下丘脑进行体外分散细胞培养，观察了下丘脑细胞的生长分化过程，并且对培养不同时间的细胞作生长抑素(SRIF)免疫细胞化学染色，阳性神经元记数，各种形态神经元所占的百分比统计。结果胚胎小鼠下丘脑SRIF阳性神经元在体外生长发育不同时间细胞指数不同：7d时为24±1.52，10d时为34±2.20，12d时为34±3.30，14d时为104±6.32，16d时为68±5.34，20d时为29±1.54，其中在培养14d时，SRIF阳性神经元达到高峰，以后出现下降趋势。而且神经元的形态、单极、双极、多极神经元的数目以及突起呈色深浅在发育过程中也有较大的变化，各种占比例较大神经元出现的时期也不一样，其中，单极在培养10、14、16d时分别占52.3%、60.0%、43.3%。双极在培养10、14、16d时分别占30.7%、20.7%、30.1%。多极神经元在培养7、12、20d时分别占81.5%、90.1%、67.3%。结论(1)在培养状态下，下丘脑不同核区的细胞发育速度不同，并且随时间点的变化呈现规律性变化；(2)不同类型的SRIF神经元的发育随着不同的时间点呈现出不同比例很可能反映一些SRIF神经元的功能发生了转化；(3)体外培养状态下SRIF神经元的发育可能反映在体SRIF神经元的情况。

【中图分类号】R322.81；R321.5【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)03-202

THE ONTOGENCY OF THE SRIF NEURONS IN THE HYPOTHALAMUS

OF EMBRYONIC MICE in vitroA STUDY OF

IMMUNOCYTOCHEMICAL STAINING

YANG Hao, LIANG Zhe, JU Gong

(Institute of Neurosciences,the Fourth Military Medical University,Xi'an710032,China)

【Abstract】ObjectiveThe purpose of the present study is to illustrate ontogency of the SRIF neurons in the hypothalamus of embryonic mice in vitro.MethodsNeurons were dissociated from the hypothalamus of embryonic mice and cultured primarily.The process of the growth and differentiation of hypothalamic neurons was observed in vitro.The cultured hypothalamic neurons were stained immunocytochemically with anti-SRIF antibody at different culture times.The number of the SRIF-positive cells,which were different in morphology,was counted and the percentages of different SRIF-positive neurons were calculated. ResultsThe numbers of the SRIF-positive cells were distinct in different growth and differentiation periods.Thus,the number of the neurons was 24±1.52,34±3.30,104±6.32,68±5.34 or 29±1.54 at 7,10,14,16 or 20 days in vitro (DIV),respectively.The number of the neurons increased with culture time,with the highest number at 14 DIV,and decreased when the culture time became longer than 14 days.Furthermore,obvious changes took place in the morphology and immunocytochemical reactivity of the neurons as well as the number of monopolar,bipolar and multipolar neurons at different time points.In addition,the highest percentages of neurons with different profiles turned up at different time points.The per-centages of the monopolar neurons were 52.3%,60% and 43.3% at 10,14 and 16 DIV,respectively,whereas the percentages of those bipolar cells represented 30.7%,20.7% and 30.1% at the corresponding time points.As for the multipolar cells,such percentages reached 81.5%,90.1%,and 67.3% at 7,12 and 20DIV,respectively. Conclusions(1)Distinct hypothalamic neurons develop at different speed under culture conditions and change regularly at different culture time;(2)distinct types of SRIF-positive neurons develop at different rates,suggesting that some of the SRIF-positive neurons may have transformed their types and functions,and (3) in vitro development of the SRIF-positive neurons may reflect their in vivo states.

【Key words】Somatotropin release inhibiting factor; Hypothalamus; Cell culture; Immuncytochemistry

SRIF为环状的14肽，它不仅是一种能够抑制生长激素释放的一种内分泌激素，而且是一种强有力的神经递质或神经调制物。其生理作用广泛而复杂。随着胚胎发育学、细胞生理学、神经内分泌学的飞速发展，作为肽类家族这种兼有激素作用的神经递质，越来越受到学者们的重视，但是关于SRIF神经元发生学方面以原代培养小鼠的下丘脑作为下丘脑细胞的发育过程的研究不多见，国内未见报道。本实验应用小鼠胚胎做下丘脑分散细胞培养，通过不同时期下丘脑神经元的个体生长发育和形态变化以及SRIF阳性神经元的形态特征，为研究在体胚胎期下丘脑SRIF神经元的分泌功能及其调节提供了一个体外途径。

材料和方法

1. 下丘脑神经元细胞培养

本工作以杂系17d的胚胎小鼠下丘脑为实验材料，采用原代培养的方法Richard^［1］等并且加以改良。将怀孕17d母鼠引颈处死，无菌条件下将胚胎小鼠的颅骨从中线剥开，将小鼠的整个脑组织全部取出。放在细胞解离液D₁-SGH(D₁为无钙镁离子Pucks液，SGH为蔗糖-葡萄糖和HEPES缓冲液)中，剔除脑膜，将脑底朝上，然后用虹膜刀分别在水平位沿视交叉和中脑各切1刀，再将切好的脑片水平放置，按文献［1］所述位置再切3刀，切弃周围组织。将分离好的下丘脑剪成碎块，移入0.125%的胰蛋白酶中于37℃5%CO₂孵育箱中作用25min。然后于胰酶终止液作用10min，最后用完全培养液［DMEM80%,胎牛血清20%(Sigma)］，制成单细胞悬液，再将细胞浓度调至1×10⁶细胞/ml，然后再将细胞接种在涂有鼠尾胶原的35mm塑料培养皿中，每皿1ml，于37℃，95%空气和5%CO₂培养箱中培养48h后，每皿加入20μl阿糖胞苷(10μmol/L)，抑制非神经元的过度增殖，以后每3d换液1次。

2. 免疫细胞化学染色

将培养7、10、12、14、16和20d的细胞用0.01mol/LPBS配制的4%多聚甲醛固定1h，然后用SRIF抗血清(1∶500Sigma产品)按ABC法进行免疫细胞化学染色，呈现阳性反应的为SRIF神经元，为避免显色人为差异，严格控制加样反应显色条件时间的一致性。然后在显微镜下进行观察，比较不同时期细胞着色情况。

3. SRIF神经元的细胞指数

将染色的标本于OLYMPUS倒置显微镜下进行观察，观察不同时间7、10、12、14、16、20d细胞的形态变化，并且分别随机选择15个视野计数阳性细胞(视野面积0.12mm²)，取平均数。

4. 下丘脑SRIF神经元在不同培养时间的类别比较

在显微镜下按突起的类别统计单极、双极、多极神经元数目，然后计算它们在培养不同时间所占细胞指数的比例。

结果

1. 细胞培养及形态学观察

胚胎小鼠的下丘脑细胞大多数在接种24h左右内贴壁，刚贴壁的细胞呈圆形，体积小，立体感强，彼此分散，培养2d后，可见大多数神经元重聚大小不等的细胞团。突起向四周长出，相邻细胞团也有纤维相连。阿糖胞苷作用后，神经元背景明显清晰。培养7d后，神经元明显可以分辨，不等大小的神经元彼此分散生长，只有少部分仍处于团聚状态。随着培养时间的延长，神经元的突起纵横交错，难以辨认突起的起源。

用SRIF抗血清进行免疫细胞化学染色后，不同时间SRIF神经元的形态特征以及着色的深浅不尽相同。7d时进行染色，着色的细胞相对少，而且胞体和突起相对淡，突起短而细，此时阳性细胞主要为多极神经元(图1)。10d后，大部分SRIF阳性神经元出现深染，胞体较大的神经元出现淡染，着色细胞多为单极和双极的小细胞，胞体约3μm左右，突起着色十分深且清晰。只有胞体较大的神经元出现淡染(图2)，胞体约20μm。培养12d进行染色，阳性细胞大多数是多极神经元，胞体为中等程度着色，突起十分清晰，而且突起上阳性颗粒明显，呈串珠样排列，也有少数多极神经元出现淡染(图3)。而且着色深浅不一，突起着色模糊，此期阳性神经元最为密集(图4)。16d时，SRIF阳性神经元是团聚的着色。单个细胞也有着色，突起与胞体着色浅，而且突起相对粗短。细胞密度较14d时小(图5)。20d后，SRIF阳性神经元密度大为下降，着色情况与10d相似，但较第10d的细胞着色浅(图6)。

2. 培养不同时间后SRIF阳性神经元的细胞指数的变化(图7)

以20倍镜下随机计数15个视野的细胞作为检测SRIF神经元指数变化的指标。结果发现，培养7、10、12、14、16、20d时，SRIF神经元数呈现峰状分布，其中14DIV细胞指数达到高峰，14DIV以后呈现下降趋势。