【摘要】目的研究热休克蛋白(Hsc70／Hsp68)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)在肝再生过程中的生物学作用，检测这些大分子在大鼠肝大部切除后热休克处理下的动态变化。方法用组织化学、免疫组织化学、Western印迹、酶的原位复性电泳、体视学分析、比色分析等方法。结果肝切除和热休克联合处理(PH-HS)后的0～144h恢复期间，ACP有3个高活性期(12、36和96h)，AKP有2个高活性期(12和36h)，Hsc70／Hsp68有2个高表达期(16和48h)；PH-HS后ACP和AKP活性增强与140～180kD的酶活性增加有关。与只进行热休克(HS)(44℃，30min)处理或与只进行2／3肝切除(PH)后恢复期间Hsc70／Hsp68含量和磷酸酶活性动态变化的比较表明，PH-HS对Hsc70／Hsp68含量和磷酸酶活性的影响可持续120h；PH-HS中的PH能略微降低ACP和AKP活性，减少HS诱导肝细胞合成Hsc70／Hsp68的量；PH-HS中的HS处理能抑制PH诱导的Hsc70／Hsp68表达和推迟ACP活性高峰出现的时间。结论ACP、AKP和Hsc70／Hsp68均在肝细胞的HS反应和肝再生中起作用，其中，ACP可能在启动肝再生中起重要作用，AKP和Hsc70／Hsp68可能在DNA合成和细胞分裂中起重要作用。

【中图分类号】Q28【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)03-239

ANALYSIS OF THE EFFECT OF HEAT SHOCK AFTER

RAT PARTIAL EPATECTOMY ON Hsc70／Hsp68

EXPRESSION AND PHOSPHATASE ACTIVITLES

XIA Min, LU Ai-ling, LI Xiao-yang, ZHAO Xu-yong, LI Yong-hui, XU Cun-shuan

(Biology Department, Henan Normal University, Xinxiang453002, China)

【Abstract】ObjectiveWe tried to probe the biological function of ACP, AKP and Hsc70／Hsp68 in liver regeneration treated by heat shock(44℃, 30min, recover 8 hours)after 2／3 hepatectomy (PH-HS). MethodsBy histochemistry, immunohistochemistry, Western-blot,non-denatured electrophoresis, sterology and colorimetry, we detected the location and content of the conserved heat shock protein70／induced heat shock protein 68 and location and activity of the acid and alkaline phosphatases(ACP and AKP). ResultsACP has three high activity-stages(12,36 and 96h), AKP has two high activity-stages(12 and 36h), and Hsc70／Hsp68 has two high expression-stages (12 and 48 h) during 0-144 h recovery time after PH-HS. The enhanced ACP and AKP activity comes from 140-180 kD phosphatases after PH-HS. Comparison of kinetics of Hsc70／Hsp68 content and ACP and AKP activity after PH-HS with that after heat shock(HS) treatment(44℃, 30min) and 2／3 hepatectomy(PH) respectively shows that the effect of PH-HS on Hsc70／Hsp68 content and phosphatase activity lasts 120 h; The PH in PH-HS can reduce ACP and AKP activity and Hsc70／Hsp68 expression. The HS in PH-HS can change the time of ACP and AKP enhancing activity and inhibit expression of the Hsc70／Hsp68 induced by PH. ConclusionACP, AKP and Hsc70／Hsp68 play an important role in heat shock response of liver cells and liver regeneration, but ACP is more important in originating liver regeneration, while AKP and Hsc70／Hsp68 probably exert the effect in DNA synthesis and cell division.

【Key words】Liver regeneration; Heat shock(HS); Conserved heat shock protein 70／induced heat shock protein 68(Hsc70／Hsp68); ACP; AKP; Rat

肝再生是一种受到机体和细胞本身精细调控的细胞去分化、增殖和再分化过程^［1］。而且也受外界因素(包括热休克处理)的影响^［2］。已有实验证明，同一种或不同种刺激按适当间隔时间连续2次或多次刺激机体和／或细胞时，前1次刺激会影响细胞对以后刺激的反应，下1次刺激也会改变细胞对以前刺激的反应，无论是热休克处理还是肝大部分切除都会引起机体和细胞发生抵抗和适应反应，这两种刺激联合使用对肝再生有何影响是值得研究的问题^［3～6］。本实验研究了2／3肝切除(2／3 hepatectomy)和热休克(heat shock)联合处理(PH-HS)对肝再生过程中ACP、AKP和热休克蛋白(Hsc70／Hsp68)的影响，结果如下：

材料和方法

1.实验动物和化学药品及试剂

成年SD纯系大白鼠，由河南师范大学生物系实验动物房提供，雌雄各半，体重200～250g。

明胶(Sigma)、Hsc70／Hsp68的一级抗体(StressGen,产品编号SPA-820，为鼠源性单克隆抗体，其制备抗原是人Hsc72／Hsp70，但亦能与人、灵长目动物、兔、大鼠和牛的Hsp70／Hsc70N端1～180氨基酸区域特异结合)、二级抗体(华美生物工程公司产品，为山羊抗鼠IgG-AP)、过氧化物酶标记链霉卵白素(SP，华美生物工程公司)，实验所用的化学试剂至少为分析纯。

2. 2／3肝切除-热休克处理(PH-HS)及样品制备

将大白鼠随机分组(每组至少3只)，乙醚麻醉，按Higgins方法切除2／3肝(即切除第1、2、3肝叶)，于室温恢复4h，接着，置于44±0.5℃的电热鼓风恒温箱内(加有湿盒)30min，然后于室温分别恢复2、4、6、8、10、12、16、20、24、36、48、72、96和144 h后，脊椎脱臼处死，摘除眼球放血，(1)用于组织化学和免疫组织化学分析时，直接切取脏脏备用；(2)用于制备匀浆液时，用肝门静脉灌注法^［7］将肝叶中的血液洗净后，取下置于加有冰冷生理盐水的培养皿中剪碎，在4℃、40mmol/L NaCl、20mmol/L Tris-HCl、pH7.5的缓冲液(材料湿重∶缓冲液=1∶5)中匀浆，12 000g离心10 min，取上清液，分装，-85℃保存备用。

3.ACP和AKP的组织化学

将肝脏切成5×5×3mm小块，置液氮中速冻后用冰冻切片机连续切片(厚8μm)，用4℃冷丙酮固定20 min，以Gomori铅法显示ACP，其中，样品在保温液中保温(37℃)40 min;以Gomori钙-钴法显示AKP，其中，样品在保湿液中保湿(37 ℃)1h；用不加β-甘油磷酸钠的作用液做阴性对照。

4.ACP和AKP活性的比色测定

取0.1ml匀浆液，加入0.4ml缓冲液(测定AKP活性时，用0.25mol/L MgCl₂、0.2mol/LTris-HCl、pH7.5；测定ACP活性时，用0.35mol/L枸橼酸-NaOH-HCl，pH5)和0.4ml 10mmol/L β-甘油磷酸钠(空白对照加0.4 ml生理盐水)混匀，37℃保温30 min后，再加入0.1 ml50%三氯乙酸(空白对照在加入匀浆液的同时，加入0.1 ml50%三氯乙酸)混匀，加2 ml三蒸水和3 ml定磷试剂(3mol/L H₂SO₄∶H₂O∶2.5%钼酸铵∶10%抗坏血酸=1∶2∶1∶1)混匀后，于45℃恒温水溶锅内保温25 min，取出冷至室温后，于660 nm处测定吸光值，从标准曲线上求出磷含量。

5. Hsc70／Hsp68的免疫组织化学

取同一肝叶的同一部位于10%福尔马林中固定24h，常规石蜡制片(厚6μm)，连续切片，每隔60μm取1片，每只动物取4片做免疫组织化学染色，其中，在1∶500稀释的一抗中于4℃过夜，在1∶200稀释的二抗中于37℃保温1h；用1∶200稀释的过氧化物酶标记的链霉卵白素(SP)法染色(37 ℃保温1h，用PBS代替一抗作阴性对照，未热休克肝作正常对照)，用微波炉(92～98℃)对切片进行10 min抗原修复，DAB系统显色，苏木精复染。

6. 蛋白质浓度测定、聚丙烯酰胺凝胶电泳和磷酸酶的原位复性电泳

按Neuhoff等^［8］方法测定匀浆液的蛋白质浓度；按Laemmli等^［9］方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和显色，检测总蛋白种类；按夏民等^［10］方法进行ACP和AKP的原位复性电泳和显色。上述电泳的上样量均为每槽75μg总蛋白。

7.Western印迹

按Towbin等^［11］方法，将SDS-PAGE凝胶板上的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上(电压500V，转移36h)，将载有蛋白质的硝酸纤维素膜以PBS／0.2% Tween 20封闭30min，弃去PBS／Tween 20，加入一抗(1∶500)稀释，37℃保温1h，每10min摇动1次，然后，用PBS洗去未结合一抗，加入二抗(1∶1 000稀释)，37℃保温1h，每10min摇动1次，之后，用PBS洗去未结合二抗，以DAB显色。

8.体视学方法定量分析Hsc70／Hsp68

按Weibel法^［12］，每只动物取5张切片在10×10(物镜)、10×40(物镜)下分别计数阳性细胞的落点数Pxi和测试视野落点数Pri，以公式Vv=∑Pxi／∑Pri，分别计算各组动物阳性细胞的体密度(其中，∑Pxi和∑Pri分别为每组动物阳性肝细胞总落点数和测试视野总落点数)，以方差分析作统计学处理。

结果

1.PH-HS后肝再生过程中ACP分布及活性变化

1.1用酶的组织化学方法测得的ACP分布及活性变化