【摘要】目的探讨β-淀粉样蛋白(Aβ)和载脂蛋白(ApoE4)对基底前脑神经元存活和生长的影响，研究Alzheimer病(AD)发病的细胞分子机制。方法体外培养基底前脑神经细胞，MTT法和免疫细胞化学方法结合体视学分析，观察Aβ31-35和ApoE4对基底前脑神经元存活及胞体和突起生长的影响。结果(1)MTT法测得的Aβ-31-35+ApoE4组的A值，与对照组比较明显减小(P＜0.05)，说明神经元的存活力降低，存活数量减少；(2)Aβ31-35+ApoE4组的神经元胞体最长径和最短径明显低于对照组和ApoE4组(P＜0.05)；平均突起长度也明显低于对照组、ApoE4组和A β31-35(10μmol/L)组(P＜0.01)；(3)Aβ31-35(20μmol/L)组平均突起长度比对照组、ApoE4组和Aβ31-35(10μmol/L)组明显减小(P＜0.01)；(4)Aβ31-35+ApoE4组和Aβ31-35(20μmol/L)组的胆碱能神经元最长突起长度、总突起长度及平均突起长度均明显低于对照组(P＜0.01)；且这两组的ChAT阳性神经元的胞体平均灰度也明显低于对照组(P＜0.05)，说明ChAT的活性下降。单独ApoE4对基底前脑神经元的存活和生长均无明显影响。结论Aβ31-35+ApoE4比单独Aβ31-35对神经元存活及胞体和突起生长的抑制作用要强，结果提示ApoE4可能有协同Aβ31-35的神经毒性效应的作用。

【中图分类号】R329.2⁺4【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)03-193

COMBINED EFFECTS OF Aβ31-35 AND ApoE4 ON NEURONAL

SURVIVAL AND GROWTH OF THE BASAL FOREBRAIN

in vitro IN THE RAT

GUO Wen-ping, RUAN Yi-wen, ZHOU Li-hua, XIE Yao, YAO Zhi-bin^*

(Division of Brain Research,Department of Anatomy,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou510089,China)

【Abstract】ObjectiveIn order to explore the combined effects of β-amyloid protein(Aβ) and apolipoprotein E4(ApoE4) on neurons in the basal forebrain in rat.MethodsThe survival and growth of cultured neurons were measured by MTT assay and immunocytochemistry combined with morphometry. Results(1)The average A values of group Aβ31-35+ApoE4 were lower than that of the control(P＜0.05),which showed that the viability and number of neurons were decreased;(2)The average maximum and minimum diameter of neurons in group Aβ31-35+ApoE4 and group Aβ31-35(20μmol/L)were decreased as compared with those of control and group ApoE4(P＜0.05);(3)The average neurite length of group Aβ31-35+ApoE4 and group Aβ31-35(20μmol/L) were decreased significantly as compared with that of control, group ApoE4 and group Aβ-31-35(10μmol/L)(P＜0.01);(4)The longest process length,the total neurite length,the average neurite and the average gray degrees of ChAT-positive neurons were decreased significantly in group Aβ-31-35+ApoE4 and group Aβ31-35(20μmol/L) as compared with those of control(P＜0.05),the decrease of the gray degrees of ChAT-positive neurons indicated that Aβ31-35+ApoE4 and Aβ31-35 reduced choline acetyltransferase activity(ChAT).ApoE4 had no significant effect on survival and morphology of the basal forebrain neurons. ConclusionThe combination of Aβ31-35 with ApoE4 is more neurotoxic than that of Aβ31-35 alone,which implies that ApoE4 may play an important role in enhancing the neurotoxicity of Aβ31-35.

【Key words】Beta amyloid protein(31-35); Apolipoprotein E4; Basal forebrain; Cholinergic neurons

β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)是老年斑(senile plaques,SP)的主要成分之一，是由39～43个氨基酸组成的多肽。SP是构成老年性痴呆(Alzheimer disease,AD)病人脑中神经病理改变的主要成分。它在脑内的产生和沉积与AD的病理过程有着密切的联系，其确切机制还不清楚。研究表明不同片段的Aβ在不同的生理状态和条件下有不同的生物活性——神经营养和神经毒性作用^［1，2］。载脂蛋白E4(apolipoprotein E type 4 allele,ApoE4)是晚发家族性AD和散发性AD的主要危险因子，在SP中也证实有ApoE4的沉积^［3］，它在AD发病中的作用还有待于阐明。体外研究显示，ApoE4易与Aβ结合形成一难溶复合物^［4］。目前对它们相互结合机制的研究较多，但两者共同作用对神经元影响的研究较少，尤其是对基底前脑胆碱能神经元的作用未见文献报道。故本实验通过从体外来研究Aβ_31-35和ApoE4对培养的大鼠基底前脑神经元存活和生长的影响，为揭示它们在AD病理中的作用提供资料。

材料和方法

1. 动物和试剂

孕18～20d的SD大鼠(由中山医科大学动物中心提供)，单克隆抗神经丝抗体，胆碱乙酰转移酶(ChAT)抗体、Aβ(31-35)、MTT、多聚赖氨酸、ApoE4(均为Sigma公司产)，胎牛血清(杭州四季青生物工程公司产)，DMEM/F12(GiBCO公司产)。

2. 神经元的培养

戊巴比妥钠(40mg/kg)经腹腔麻醉SD孕鼠，在无菌操作下取出胎鼠，分离出基底前脑，置于盛有D-Hank液的青霉素瓶中，将组织剪碎，加入0.125%的胰蛋白酶，消化15～20min，用含有15%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，经悬浮、离心、过滤后收集细胞，按1×10⁵个细胞/毫升的密度接种在预先涂有多聚赖氨酸的96孔板内；按2×10⁵个细胞/毫升的密度接种在24孔培养板内的盖玻片上(0.8×0.8cm²)，待细胞贴壁后换含B27添加剂的无血清培养基。将细胞分组并分别加入等体积的5mg/L、10mg/L、20mg/L的ApoE4，10μmol/L、20μmol/L的Aβ(31-35),ApoE4(10mg/L)+Aβ31-35(10μmol/L)及ApoE4(10mg/L)+Aβ31-35(20μmol/L)试剂。对照组以等量的无血清培养基替代，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。96孔板中的神经元培养48h，用于测量神经元的存活；24孔板中的神经元培养4d，用于形态学观察神经元胞体和突起的生长。另24孔板中的神经元培养10d(每3d换1次含有等量试剂的培养基，并加入阿糖胞苷，抑制非神经元的生长和增殖)，用于观察胆碱能神经元的生长。

3. 培养神经元的鉴定及胆碱能神经元的染色

用抗神经丝抗体(1∶120)标记培养4d的基底前脑神经元，用ChAT抗体(1∶250)标记培养10d的胆碱能神经元，上述标记均用免疫组织化学ABC法。

4. Aβ31-35的“老化”处理

将1mg的Aβ31-35溶解在1ml的双蒸水中，经0.22μm滤器过滤除菌后，置于37℃恒温箱内孵育4～7d，即为老化状态。

5. 快速自动比色微量分析(MTT比色微量分析)

四唑氮盐［3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT］。终止培养前4h，每孔加入10μl MTT(1.5g/L DMEM)继续培养，4h后每孔加入100μl 0.08mol/L的盐酸-异丙醇溶液终止反应，吹打蓝色颗粒产物匀后，将96孔培养板置于酶标仪下，采用实验波长为570nm和参考波长为630nm，测量每孔样品中MTT阳性产物的光密度值(A值)。

6. 图像分析和统计学分析

采用德国KONTRON公司IBAS Rel,2.0图像分析系统测量神经元胞体的最长径、最短径和突起长度及ChAT阳性神经元胞体的灰度、最长突起长度、总突起长度。统计学分析，分别用参数检验和非参数检验，两两比较用Newman-kenls检验，非齐性检验用F检验，以0.05和0.01为显著性标准。

结果

1. Aβ31-35和ApoE4对基底前脑神经元存活的影响

神经元存活力是通过测定MTT在线粒体脱氢酶代谢过程中形成的有色产物的A值来评价，A值高反映了神经元存活力强，存活数量多。MTT法测量结果显示：Aβ31-35和ApoE4单独作用各组测定的A值与对照组比较无明显差异。Aβ31-35(10μmol/L)+ApoE4(10μmol/L)和Aβ31-35(20μmol/L)+ApoE4(10mg/L)两组测得的A值分别为0.172±0.021，0.155±0.014，比对照组(0.208±0.018)低，有显著差异(P＜0.05)，说明Aβ31-35+ApoE4对基底前脑神经元存活有抑制作用(图1，2a,2b)。

图1Aβ31-35和ApoE4作用于培养的基底前脑神经元48h，神经元存活的情况 *表示与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)

Fig.1The change of the A values of neurons treated with Aβ31-35 and ApoE4 for 48h relative to viability of cells by MTT assay* compared with control P＜0.05

2. Aβ31-35和ApoE4对培养基底前脑神经元生长的影响

由表1可见，Aβ31-35(20μmol/L)组、Aβ31-35+