【摘要】目的探讨一氧化氮(NO)对大鼠脑皮质离子型谷氨酸受体(NMDA、AMPA、KA受体)和GABA受体的影响。方法将Wistar大鼠腹腔注射神经细胞结构型一氧化氮合酶抑制剂7-硝基吲唑，以氚标配体分别标记NMDA、AMPA、KA和GABA_A受体，用图像分析仪对大鼠额区、顶区、后肢区、梨状区、压部后区和味觉区皮质内标记受体进行定量分析。结果实验组大鼠额区、后肢区和梨状区内NMDA、AMPA、KA受体和GABA_A受体含量均显著增加；顶区皮质内NMDA、KA受体和GABA_A受体增加显著；味觉区皮质内KA受体增加显著。结论NO可能参与大鼠脑皮质离子型谷氨酸受体和GABA受体水平的调节。探讨一氧化氮(NO)对大鼠脑皮质离子型谷氨酸受体(NMDA、AMPA、KA受体)和GABA受体的影响。方法将Wistar大鼠腹腔注射神经细胞结构型一氧化氮合酶抑制剂7-硝基吲唑，以氚标配体分别标记NMDA、AMPA、KA和GABA_A受体，用图像分析仪对大鼠额区、顶区、后肢区、梨状区、压部后区和味觉区皮质内标记受体进行定量分析。结果实验组大鼠额区、后肢区和梨状区内NMDA、AMPA、KA受体和GABA_A受体含量均显著增加；顶区皮质内NMDA、KA受体和GABA_A受体增加显著；味觉区皮质内KA受体增加显著。结论NO可能参与大鼠脑皮质离子型谷氨酸受体和GABA受体水平的调节。

【中图分类号】R322.81【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)03-265

EFFECT OF NITRIC OXIDE SYNTHASE INHIBITOR

7-NITROINDAZOLE ON IONOTROPIC GLUTAMATE

RECEPTOR AND GABA_A RECEPTOR

IN CEREBRAL CORTEX OF THE RAT

7-NITROINDAZOLE ON IONOTROPIC GLUTAMATE

RECEPTOR AND GABA_A RECEPTOR

IN CEREBRAL CORTEX OF THE RAT

WU Jian-zhongZHI YeBidmon H J

Department of Anatomy,North China Coal Medical College,Tangshan063000,China

Department of Neuroanatomy,Heinrich-Heine University,40001 Düsseldorf,Germany

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of nitric oxide (NO) on ionotropic glutamate receptors and GABA receptors in cerebral cortex of the rat.MethodsThe animals were injected with neuronal nitric oxide synthase inhibitor 7-nitroindazole(30 mg/kg,i p).The receptors in cerebral cortex were bound with［³H］MK-801 for NMDA receptors(NMDAR),［³H］AMPA for AMPA receptors(AMPAR),［³H］Kainate for kainate receptors(KAR) and ［³H］ muscimol for GABA_A receptors(GABA_AR),respectively,and quantitative analysis was used to study the changes of the receptors in some cortical areas.ResultsSix hours after the injection,NMDAR,AMPAR,KAR and GABA_AR in frontal cortex(Fr),hindlimb area(HL) and prepiriform cortex(Pir)were markedly increased as compared with that of the control rats.In parietal cortex(Par) or in gustatory cortex(Gu),NMDAR,KAR,GABA_AR or KAR were markedly increased respectively. ConclusionNO might be related to the regulation of ionotropic glutamate receptors and GABA receptors in cerebral cortex of the rat.

【Key words】7-nitroindazole;Receptor;Autoradiography;Cerebral cortex;Rat

近年发现，一氧化氮(NO)是具有重要生理和病理功能的信息分子，广泛参与体内多种生命过程。NO由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)以L-精氨酸为底物合成。在中枢神经系统，神经细胞结构型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)分布广泛，其催化产物NO可能作为一种逆向信息传递物质参与海马的长时程突触传递增强(LTP)以及小脑的长时程突触传递抑制(LTD)过程，参与神经递质释放的调节、动物的学习和记忆以及痛觉的调制等。在病理状态下，NO涉及到脑缺血、癫痫、神经变性型疾病等多种病理过程^［1，2］。由于NO性质活泼、半衰期短，研究中常采用NOS抑制剂间接观察NO的在体作用。本实验采用nNOS特异性抑制剂7-硝基吲唑(7-nitroindazole,7-NI)，间接观察NO对大鼠额区、顶区、后肢区、梨状区、压部后区和味觉区等脑皮质区内离子型谷氨酸(NMDA、AMPA、KA受体)和GABA受体的影响。

材料和方法

成年雄性Wistar大鼠14只，体重200～250g，对照组7只，腹腔注射生理盐水；用药组7只，腹腔注射7-硝基吲唑(30mg/kg)。动物存活6h后，断头取脑，液氮冷冻。取端脑经恒冷箱切片机连续横切片，片厚15μm，贴于明胶载片上，置入真空瓶内，－25℃冰箱干燥过夜。取各脑的相邻切片，分别用于Nissl染色和受体标记。

1. 受体标记

1.1NMDA受体结合：切片入50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，25℃预反应15 min，移入含放射性配基［³H］MK-801(浓度5 nmol/L)孵育液，继续孵育60 min。Tris-HCl(4℃)缓冲液冲洗4次，每次2s，切片用2×3ml丙酮/戊二醛(100/2.5ml)迅速固定，冷风吹干。受体的特异性结合由［³H］MK-801的总结合量减去30μmol/L甘氨酸和50μmol/L精胺存在下的非特异性结合量后计算得出。

1.2AMPA受体结合：切片入50 mmol/L Tris-acetat缓冲液(pH7.2)，4℃预反应3×10min，移入含放射性配基［³H］AMPA(浓度10 nmol/L)孵育液，继续孵育45min。如上所述进行冲洗、固定和吹干。非特异性结合加入10μmol/L使君子酸。

1.3KA受体结合：切片入50 mmol/L Tris-citrate缓冲液(pH7.1)，4℃预反应3×10min，移入含放射性配基［³H］海人酸(浓度8 nmol/L)孵育液，继续孵育45min(4℃)。如上所述进行冲洗、固定和吹干。非特异性结合加入100μmol/L海人酸。

1.4GABA_A受体结合：切片入50 mmol/L Tris-citrate缓冲液(pH7.0)，4℃预反应3×10min，移入含放射性配基［³H］蝇蕈醇(浓度3 nmol/L)孵育液，继续孵育40min(4℃)。如上所述进行冲洗、固定和吹干。非特异性结合加入10μmol/L GABA。

2. 曝光

将切片贴于承托板上，覆盖氚片(hyperfilm,Amersham)，在4℃冷室中与氚标准(microscales,Amersham)同时曝光，时间为4周(AMPAR、KAR)、5周(NMDAR、GABA_AR)。曝光完毕，用D-19b显影液和F-5定影液分别显影5min和定影10min，自来水冲洗30min后，自然干燥。

3. 受体定量分析

采用IBAS 2000图像分析仪(Kontron, Germany)测量不同脑皮质区标记灰度值，详细方法见Zilles等^［3］的研究。脑皮质分区，按大鼠脑图谱由相邻Nissl染色切片在显微镜下重叠标出。相对于每个受体，每只动物至少检测6张切片。特异结合等于总结合量减去非特异结合量，所测灰度值借同期曝光校定的氚标准转变为fmol/mg蛋白放射性结合量。

结果和讨论

与对照组相比，腹腔注射7-硝基吲唑6h后，实验组大鼠脑皮质内标记的4种受体量均有不同程度的增加，而各受体的区域分布类型无变化(图1～5)。选择额区(Fr)、顶区(Par)、后肢区(HL)、梨状区(Pir)、压部后区(RS)和味觉区(Gu)等脑皮质区进行受体定量分析显示：NMDA受体在Fr、HL、Par₂、和Ptr脑皮质区，AMPA受体在Fr、HL和Pir脑皮质区，KA受体在Fr、HL、Par₂、Gu和Pir脑皮质区，GABA_A受体在Fr、HL、Par₁、Par₂和Pir脑皮质区增加显著。用药组动物RS区4种标记受体量与对照组比无明显差异(附表)。

7-硝基吲唑作为一种新型的NOS抑制剂，特异性抑制nNOS活性，与其他类NOS抑制剂相比较，其在体内的升压效应极小，更适合用于中枢神经系统NO作用的研究^［4］。本研究将7-NI注入大鼠腹腔6h后，定量观察了部分脑皮质区内兴奋性氨基酸受体(NMDAR、AMPAR、KAR)和抑制性氨基酸(GABA_A)受体的变化。结果显示，7-NI能明显增加以上受体在特定脑皮质区的含量，且这些皮质区域恰为nNOS阳性神经元分布较为密集的区域^［5］，提示NO可能对调节脑的受体水平发挥重要作用。用药组动物脑皮质内标记受体量的增加，提示有受体阳性神经元合成受体量增加或因受体亲合力的改变导致标记受体量增加两种可能性，其详细机制有待于进一步研究。我们对7-NI能否直接影响受体亲和力未进行研究，因此不能排除该抑制剂对受体标记量的直接影响。

附表大鼠脑皮质区不同受体定量分析(x±s)

TableQuantitative analysis of different receptors in cerebral cortex of the rats<