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【中图分类号】R329.2【文献标识码】A
【文章编号】0529-1356(2000)02-157
THE STUDY OF SCHWANN CELL MIGRATING BETWEEN THE
WELL PLANE AND STEREOFRAME OF POLYGLYCOLIC
ACID ON CELL CULTURE
WANG Xiao-dong, ZHANG Pei-yun, ZHANG Yu-dong, YANG Liu
（Department of Histology and Embryology;）
GU Xiao-song
（Institute of Neuroscience,）
ZHANG Tian-yi
（Laboratory of Electron Microscopy,Nantong Medical College,Nantong 226001,China）
【Abstract】Objective To investigate the migrating characteristic of culturing Schwann cell (SCS)on the plane or the fibre frame of polyglycolic acid(PGA). Methods The morphology of SCS on the plane or on the stereoframe was observed under inverted phase contract microscope and scan electric microscope of regular intervals. Results On the plane SCs showed spindle shape,which were connected with the extensions of cells.The cells,in the same population,were unanimous on the migrating direction and speed.There were two kinds of the shape of SCs on the stereoframe,spherical cells or long olivary cells;Cells contacted each other too.The migrating speed of cells on the stereoframe was faster than that on the plane;and the long olivary cells being faster than the spherical cells.There was a angle between two axes of the long olivary cell and fibre.The long olivary SCs were trending to wrapping fibre up. Conclusions Experimental study of co-culture showed that there was a good biological compatibility between fibreframe of PGA and SCS.Compared with SCs on the plane,SCs migrated easily on the stereoframe.The long olivary cell of SC was still trending to wrapping fibre up without neurons.
【Key words】 Schwann cell; Polyglyooli acid; Stereoframe; Cell migration
在神经系统发生过程中，施万细胞(Schwann cell,SCS)沿轴索迁移形成周围神经的有髓神经纤维髓鞘；在周围神经纤维损伤后，SCS能增生、迁移形成细胞索(Büngner带)，并以细胞桥形式把神经断端连接起来，轴突长入并形成髓鞘［1］。因此周围神经纤维的发生或再生均涉及SCS的迁移问题，但在体内要观察到SCS的迁移过程是困难的，体外培养条件下对研究SCS的迁移变化主要局限于平面水平上。为此，我们用具有较好生物相容性的人工合成的生物降解材料聚乙醇酸(PGA)纤维［2］为SCS培养构建三维环境；并用光、电镜及免疫细胞化学等方法观察SCS在立体网架上迁移变化的特征，同时与平面的培养进行比较，为研究周围神经发生和再生过程中SCS的迁移提供实验依据。
材料和方法
1. SCS培养
新生1～2d的SD大鼠18只(本院动物实验中心提供)，于无菌条件下取坐骨神经和臂丛神经。在体视显微镜下剥除神经外膜，用L15基础培养液(Gibco公司)洗涤，再把神经切成0.1mm3小块，贴附于24孔培养板的孔底圆型盖玻片上(预先涂布鼠尾胶原)。加入适量完全培养液(用含10%小牛血清的L15培养基，内加青霉素和链霉素各105IU/L)，37℃、5%CO-2培养箱培养。每隔1d换培养液1次，培养3周。
2. PGA三维网架构建
直径10～15μm的人工生物降解材料PGA纤维(中国南通)用蒸馏水反复泡洗后高压消毒，用基础培养液浸泡片刻。在SCS培养24h后加入培养孔中，让纤维交叉散布在孔底，形成孔底的三维网架。部分培养孔底不加纤维，作三维立体培养环境的对照组。
3. 光镜观察与测量
每天在倒置显微镜下观察培养的细胞，用测微尺分别测量SCS在三维网架上和无网架的培养孔底上的迁移距离。
4. 培养细胞的免疫细胞化学染色
参照Gu等［3］方法，用酶联免疫细胞化学法。取培养14d的培养物用4%多聚甲醛(内含5%蔗糖)室温固定，0.2%Triton-100以及1%羊血清和小牛血清白蛋白等预处理。1∶400小鼠抗牛S-100蛋白抗体为一抗(Sigma公司)，室温中孵育4h；然后用1∶400 HRP标记的羊抗小鼠抗体为二抗(Gibco公司)，室温中孵育4h；DAB暗处显色，硫酸镍胺加强。最后脱水、透明和封片。
5. 扫描电镜观察
培养7d或14d的标本经基础培养液洗涤后2%戊二醛(4℃)固定，洗液洗涤，再用1%锇酸(4℃)后固定，乙醇逐级脱水。HCP-2临界点干燥仪(HITCHI公司)干燥，在JFC-1100离子溅射仪(JEOL公司)中喷金，JEM-T300扫描电镜(JEOL公司)观察。
结果和讨论
1. 倒置显微镜观察
对照组植块培养24h，35%的神经植块可见少数细胞开始移出，SCS迁移最远约0.06mm。48h，70%植块有细胞移出，细胞数较多，迁移最大距离为0.12mm。72h有90%的植块迁出细胞，原有的细胞生长良好，迁出细胞数增多，迁移距离达0.15mm，见细胞开始端对端或交错排列成细胞束，以植块为中心向四周放射状迁移。培养到1周时，植块外的细胞数继续增多，最远距离为0.46mm以上，细胞除成束排列外，还有成堆聚积现象，形成具有特征性的“细胞岛”。培养至2周时，植块间迁移出的细胞基本融合，细胞放射状排列的方式消失。平面上的SC形态主要表现为长梭形，少数成三角形。在实验组中，三维网架环境中培养48h的植块，可见少数细胞开始爬到距离最近的PGA纤维上，细胞长橄榄形或球形。72h，位于细胞迁出路径和PGA纤维的交叉处，可见许多细胞伸出细长的突起和PGA纤维相连，PGA纤维上的细胞增多，细胞在PGA纤维上每天约迁移0.08mm(图1)。6d时，PGA纤维上的细胞更多，细胞仍呈两种形态，每根纤维上均为一种形态的细胞；球形细胞成串珠状排列，长橄榄形细胞间多以突起首尾相接。在纤维交叉处，SCS可呈多极性迁移，但始终沿纤维方向迁移。到2周时，可见到长橄榄形细胞螺旋式包裹PGA纤维；至10d左右，PGA纤维上的细胞逐渐多于同孔底部平面的细胞。
1在三维网架中培养72h，SCS开始向纤维上迁移。×200
Fig.1 Cultured for 72h on the stereoframe of PGA,SCS migrated on the fibre. ×200
2. 免疫细胞化学法观察
孔底平面上的长梭形细胞胞体及突起均呈棕褐色，核不显色，突起末端足板染色较弱，紧贴于培养孔底或相邻细胞上(图2)。成纤维细胞呈阴性。PGA纤维上的细胞不论球形或长橄榄形均呈S-100阳性，同时可见长橄榄形细胞的膨大足板贴于PGA纤维上(图3)。
