【摘要】目的探讨EGF、TGFα、TGFβ1、PDGF、bFGF对肺泡Ⅱ型细胞增生的影响。方法在原代培养的成年大鼠肺泡Ⅱ型细胞中，加入不同种类、不同剂量的生长因子，作用48h，测定³H-TdR掺入、细胞数量和Ki-67标记指数。结果EGF、TGFα均促进肺泡Ⅱ型细胞³H-TdR掺入量、细胞数量及Ki-67阳性标记率增加，TGFα比EGF的作用更强；TGFβ1的作用与EGF、TGFα相反。EGF、TGFα和TGFβ1对肺泡Ⅱ型细胞增生的影响均呈明显量效关系。PDGF和bFGF对肺泡Ⅱ型细胞增生的影响未显示出明确的量效规律。同时或先后加入TGFα和TGFβ1，肺泡Ⅱ型细胞的增生反应不同。结论EGF、TGFα和TGFβ1对培养的成年大鼠肺泡Ⅱ型细胞增生有明显的调控作用；TGFα和TGFβ1共同作用于细胞时，其生物效应与加入不同因子的时序有关。

【中图分类号】R349.3；R392.11【文献标识码】A

【文章编号】0529-1356(2000)02-152

EFFECTS OF GROWTH FACTORS ON THE PROLIFERATION

OF ADULT RAT ALVEOLAR TYPE Ⅱ CELLS

ZENG Qing-fu QIAN Zhong-fei，JIANG Hai-ying

（Department of Pathology,）

SUN Qu-bing

（Institute of Cancer Research,）

SU Tao

（Radioimmunologic Centre,Hunan Medical University,Changsha 410078,China）

【Abstract】Objective To study in vitro effects of epidermal growth factor(EGF)

,transforming growth factor α and β1(TGFα,TGFβ1)，platelet derived growth factor(PDGF),and basic fibroblast growth factor(bFGF) on proliferation of alveolar type Ⅱ cells isolated from adult rat.Methods ³H-TdR incorporation,cell counting,and Ki-67 labeling index were used in this experiment.Results Both EGF and TGFαincreased ³H-TdR incorporation,cell numbers,and Ki-67 labeling index as compared with the control.TGFα effect was stronger than that of EGF.The effect of TGFβ1 was contrary with EGF and TGFα.Effects of EGF,TGFα,and TGFβ1 on alveolar type Ⅱ cells were dose-dependent,but there was no consistent dose-dependent response to either PDGF or bFGF.Cooperative effects of TGFα and TGFβ1 revealed that when TGFα and TGFβ1 were added simultaneously,or TGFα was added prior to TGFβ1.TGFα did not express the stimulating effect as used alone,but the inhibiting effect of TGF β1 was demonstrated.On the contrary,when TGFβ1 was added first,then addition of TGFα exhibited significantly stimulative effect.Conclusion Special growth factors including EGF,TGFα,and TGFβ1 have been implicated in the regulation of proliferation of cultured alveolar type Ⅱ cells isolated from adult rat.

【Key words】 Epidermal growth factor; Transforming growth factor alpha; Transform

ing growth factor beta; Platelet derived growth factor; Basic fibroblast growth fact

or; Alveolar type Ⅱ cell; Rat

肺泡Ⅱ型细胞是肺泡上皮的干细胞，参与肺生长发育、损伤修复过程。已有研究表明，人及动物肺损伤病变中均出现肺泡Ⅱ型细胞增生，本室研究发现，成年大鼠吸入石英粉尘或有机粉尘可致肺泡Ⅱ型细胞数量增多，体积增大^［1，2］。

近年有关生长因子参与肺泡Ⅱ型细胞增生的体内外实验研究已有一些报道^［3，4］，由于肺泡Ⅱ型细胞分离纯化及培养均有一定的难度，国内尚缺乏体外研究报道，国外的研究主要集中在新生肺和胎肺肺泡Ⅱ型细胞。尚有许多问题有待进一步探讨，如不同年龄动物肺泡Ⅱ型细胞对生长因子反应的差异性；多种生长因子的协同作用对肺泡Ⅱ型细胞的影响；肺泡Ⅱ型细胞与其他肺细胞的相互作用是否受生长因子介导等。本实验用³H-TdR掺入、细胞计数、Ki-67标记指数，探讨表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α和β1(TGFα,TGFβ1)、血小板源性生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养的成年大鼠肺泡Ⅱ型细胞增生的影响。

材料和方法

1. 肺泡Ⅱ型细胞分离纯化及原代培养

实验动物为体重140～180g雄性SD大鼠共9只(鼠龄3～4月，清洁级)(湘雅医院动物科)。细胞分离培养按我室建立的方法进行^［5］。经大鼠IgG(中国军事医学科学院)粘附纯化后的肺泡Ⅱ型细胞，碱性磷酸酶(AKP)染色，细胞纯度在90%以上。实验分3次进行，每次分离3只大鼠细胞供实验用。

2. ³H-TdR掺入

纯化后的肺泡Ⅱ型细胞用含20%FCS(杭州四季青生物材料研究所)的DMEM(Gibco/BRL)培养基调节细胞浓度至7×10⁵个/ml，按4×10⁵细胞/cm²的密度接种于24孔培养板中(相当于每孔1ml悬液)，置5%CO₂培养箱中培养24h。去除未贴壁细胞，更换含10%FCS的DMEM新鲜培基，同时加5μCi/ml ³H-TdR(30Ci/mmol,中国科学院上海原子能研究所)及不同剂量(0.01～100μg/L)的生长因子［包括rhEGF,rhTGFα,natural TGFβ1(Promega),rhbFGF(Baehringer Mannheim,B.M)，PDGF-BB(Austral Biologicals)］,同一剂量置3个复平孔。继续培养48h后用0.06%胰蛋白酶/0.01%EDTA消化收集细胞于玻璃纤维滤纸上，10%三氯乙酸固定，无水乙醇干燥。置37℃过夜烘干，将纤维滤纸置于闪烁瓶中加5ml混合闪烁液，Beckman LS3801液闪仪测定DMP值。

3. 细胞计数

肺泡Ⅱ型细胞培养24h，换液后第1次细胞计数作为基数。更换含10%FCS的DMEM再培养48h后对加生长因子的实验孔和未加生长因子的对照孔进行第2次细胞计数。计数方法^［6］：在装有目测试格倒置显微镜下，随机计数培养孔中单位面积(1/16mm²)内细胞数，每1实验组计数6个单位面积，取其均值作为该组的细胞密度。

4. Ki-67阳性表达率

肺泡Ⅱ型细胞加生长因子培养48h后胰酶消化，细胞涂片，4℃丙酮固定30min，常规免疫组织化学SP法染色(Ki-67小鼠单抗为Santa Cruz产品，SP试剂盒为Maxin Biotech产品)，实验设阳性对照和阴性对照。光镜观察，每1实验组计数300个以上细胞中的Ki-67阳性细胞数。

5. TGFα和TGFβ1协同作用实验

肺泡Ⅱ型细胞培养24h后，分6组：A组，对照组，不加任何生长因子；B组，TGFα组(100μg/L);C组，TGFβ1组(10μg/L);D组，TGFα(100μg/L)和TGFβ1(10μg/L)同时加入培养基中；E组，TGFα(100μg/L)作用6h后加TGFβ1(10μg/L)；F组：TGFβ1(10μg/L)作用6h后加TGFα(100μg/L)。每组3个复平孔，按上述方法测定肺泡Ⅱ型细胞³H-TdR掺入和细胞计数。

6. 统计分析

³H-TdR掺入和细胞计数的数据以(±)表示，多组间比较用方差分析，两组间比较用t检测，Ki-67阳性细胞以百分率表示，两样本率用u检验。

结果

1. 不同浓度生长因子对肺泡Ⅱ型细胞³H-TdR掺入的影响

随EGF或TGFα浓度递增(0.1～100μg/L)，肺泡Ⅱ型细胞³H-TdR掺入量逐渐增大，呈量效正相关。与对照组比较，EGF，TGFα均能明显促进肺泡Ⅱ型细胞³H-TdR掺入(P＜0.05和P＜0.01)。在相同剂量下，TGFα的促进作用比EGF更强(P＜0.01)(图1)。

1EGF和TGFα对肺泡Ⅱ型细胞³H-TdR掺入的影响

Fig.1 The effect of EGF,TGFα on ³H-TdR incorporation of

alveolar type Ⅱ cells

随TGFβ1浓度递增(0.01～10μg/L)，³H-TdR掺入量则逐渐减少，TGFβ1能明显抑制肺泡Ⅱ型细胞³H-TdR掺入，呈量效负相关(P＜0.01)(图2)。

2TGFβ1对肺泡Ⅱ型细胞³H-TdR的影响

Fig.2 The effect of TGFβ1 on ³H-TdR incorporation of