【摘要】目的研究迷走神经在免疫系统至延髓内脏带(MVZ)通路中的可能性。方法对雄性SD大鼠行膈下双侧迷走神经干切断术或假切断手术，存活4周后再经腹膜腔注入免疫刺激剂脂多糖(LPS)或无菌生理盐水(NS)，3h后处死，用免疫组织化学ABC法对MVZ进行Fos染色。结果假手术组大鼠腹腔给予LPS后，MVZ可发现大量Fos表达；膈下迷走神经切断术组大鼠腹腔给予LPS后，MVZ内的Fos表达量则明显减少。结论迷走神经参与外周免疫信息向中枢的传递，外周免疫信息可经迷走神经传至MVZ，MVZ是“免疫-脑通讯”的中继站，机体内存在“迷走神经→MVZ”神经免疫调节通路。研究迷走神经在免疫系统至延髓内脏带(MVZ)通路中的可能性。方法对雄性SD大鼠行膈下双侧迷走神经干切断术或假切断手术，存活4周后再经腹膜腔注入免疫刺激剂脂多糖(LPS)或无菌生理盐水(NS)，3h后处死，用免疫组织化学ABC法对MVZ进行Fos染色。结果假手术组大鼠腹腔给予LPS后，MVZ可发现大量Fos表达；膈下迷走神经切断术组大鼠腹腔给予LPS后，MVZ内的Fos表达量则明显减少。结论迷走神经参与外周免疫信息向中枢的传递，外周免疫信息可经迷走神经传至MVZ，MVZ是“免疫-脑通讯”的中继站，机体内存在“迷走神经→MVZ”神经免疫调节通路。

【中图分类号】R322.81【文献标识码】A

【文章编号】0529-1356(2000)02-97

SUBDIAPHRAGAMATIC VAGOTOMY INHIBITS Fos EXPRESSION IN

THE MEDULLARY VISCERAL ZONE AFTER INTRAPERITONEAL

ADIMINISTRATION OF LIPOPOLYSACCHARIDE

YANG Zhi-jun,RAO Zhi-ren,QIU Jian-yong,JU Gong

(Institute of Neuroscience,the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032,China)

【Abstract】Objective To test the possibility that the vagus nerve is involved in the communication between the immune system and the medullary visceral zone(MVZ).Methods Male Sprague-Dawley rats were received either subdiaphragmatic vagotomy or sham operation.Four weeks later,rats were challenged with pyrogen-free saline or lippolysaccharide(LPS) by intraperitoneal route,and sacrificed 3hrs later.Medulla sections were processed for Fos immunoreactivity using ABC method. Results Intraperitoneal LPS caused robust Fos expression within the MVZ in the sham surgery groups and this response in the MVZ was inhibted in the vagotomized rats. Conclusions This study suggested that the abdominal vagus nerve consituted an important immune signaling pathway from immune system to the MVZ,and MVZ was a relay station in the immune-to-brain communication.MVZ might play a prominent role in the neuroimmunomodulation via vagus-to-MVZ neuroimmunomodulatory pathway.

【Key words】 Medullary visceral zone;Neuroimmunomodulation;Subdiaphragamatic vagotomy;Fos;Lipopolysaccharide;Immunohistochemistry

现已公认中枢神经系统与免疫系统之间存在相互调节，但中枢神经系统哪些部位参与免疫调节是一个尚未解决的问题。有文献证实，下丘脑室旁核(PVN)的催产素(oxytocin)能神经元，可通过下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)或下丘脑-脊髓-交感神经轴参与免疫调节^［1］。近年研究发现大鼠、猴和人的延髓中尾段均存在一条从背内侧经中间网状结构至腹外侧的弧形带状区，因与内脏活动(心血管、呼吸和胃肠活动等)有密切关系，故称之为延髓内脏带(medullary visceral zone,MVZ),MVZ这一新的概念已被国际学术界认可^［2］。MVZ被划分为背内侧部［DM，包括孤束核(NTS)、迷走神经背运动核(dmnX)及最后区(AP)］、腹外侧部［VLM，包括疑核(nA)、外侧网状核(LRt)及腹外侧网状核(VLRt)］和中间网状带(IRt，指位于两者之间的弧形网状带)三部分，延髓生命中枢位于MVZ内^［3］。MVZ对免疫反应的刺激也很活跃，将免疫激活剂脂多糖(LPS)注入腹腔^［4］或将白细胞介素-1β(IL-1β)注入侧脑室^［5］，均在MVZ内见到许多Fos阳性神经元，其中多为儿茶酚胺能，有的投射至脊髓中间带外侧核。迷走神经可能是“免疫-脑通讯”(immune-to-brain communication)的途径之一，机体内可能还存在“MVZ-迷走神经-免疫器官”的“免疫-脑通讯”调节通路。为此，我们切断大鼠双侧膈下迷走神经，观察再经腹腔给予LPS后MVZ内的Fos表达情况，以证明“迷走神经→MVZ”通路参与神经免疫调节的可能性。

材料和方法

成年雄性上海SD大鼠24只，体重180～230g，置于安静、温暖(20℃)、避强光的环境中饲养48h，随机分为实验组(n=20)和对照组(n=4)。

1. 实验组

1.1动物手术及切片制备(n=20)：实验组动物进一步随机分为迷走神经切断(SDV)组(n=10)和假手术(Sham)组(n=10)。SDV组动物经1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉下行剖腹术，在手术显微镜下，于胃小弯处暴露迷走神经左右两干支，距离迷走神经各分支(胃支、肝支和腹腔支)约5mm，丝线结扎左右两干支并切断。Sham组动物，同样暴露迷走神经左右两干支，但不结扎也不切断迷走神经。术后给予固体食物。动物存活4周后，乙醚吸入麻醉，腹腔分别注射300μl灭菌生理盐水溶解的LPS(Sigma,0127:B8,100μg/kg)和300μl灭菌生理盐水(NS)，动物再存活3h。戊巴比妥钠深麻下，开胸经左心室至升主动脉插管，先以100ml生理盐水冲洗血液，随后用冷的(4℃)含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PB，pH7.4)灌流固定。灌毕取脑置于含30%蔗糖的0.1mol/L PB内(4℃)，直至组织块沉底。切取延髓，冰冻连续冠状切片，片厚30μm,隔6张取1张。

1.2染色反应：切片则按ABC法进行抗Fos免疫组织化学反应，切片先入含0.3%Triton X-100的PBS浸泡30min(室温)，后依次入：(1)兔抗Fos抗体稀释液(1∶1 000，Santa Cruz)，孵育48h(4℃)；(2)生物素标记的羊抗兔IgG(1∶500,Sigma)，放置3h(室温)；(3)生物素-卵白素-HRP复合物(ABC，1∶500,Sigma)，放置3h(室温)。最后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺法呈色。以上每一步骤之后均用PBS液充分漂洗3次，每次10min。切片漂洗后裱片、晾干、脱水、透明、封固，光镜下观察并摄片。

1.3数据处理：切片经图像分析仪(Quantimet570C,Leica)处理。Fos阳性细胞计数分别选择MVZ内DMM、IRt和VLM。每只大鼠随机选取一套延髓切片，在10(目镜)×20(物镜)倍率下，计算该套切片中MVZ内上述各部Fos阳性细胞的总和，而后在每组动物间取均数。最后各实验组之间Fos阳性细胞数比较采用t检验进行统计分析。

1.4免疫组织化学染色替代实验：取实验组大鼠延髓切片，用0.01mol/L PBS代替兔抗Fos第一抗体，再按ABC法进行免疫组织化学染色。

2. 对照组

2.1空白对照实验(n=2)：正常大鼠在上述安静环境饲养48h后，不经手术处理，戊巴比妥钠麻醉下灌流固定、取材，延髓切片按ABC法进行Fos免疫组织化学染色。

2.2生理盐水对照实验(n=2)：正常大鼠在乙醚吸入麻醉后，经腹腔注入300μl NS，存活3h后，戊巴比妥钠麻醉下灌流固定、取材。延髓切片进行Fos免疫组织化学染色。

结果

1. 假手术组动物

存活4周后腹腔注射NS组(Sham-NS组)，MVZ内可发现少数浅染的Fos阳性细胞。腹腔注射LPS组动物(Sham-LPS组)，则在MVZ内发现大量的Fos阳性细胞，多数为深染(图1，3)。两侧呈对称性分布，无侧别差异。从延髓尾吻方向看，Fos阳性细胞由尾侧向吻侧逐渐增多，但闩吻侧平面较少。从横切面上看，Fos阳性细胞多集中分布于DMM内的孤束核联合亚核(nCOM)、内侧亚核(mNTS)和AP，其次分布于VLM、IRt内Fos阳性细胞相对较少，主要分布于IRt内侧部。dmnX和nA内均未见Fos阳性细胞分布。

2.迷走神经切断组动物

存活4周后腹腔注射NS组(SDV-NS组)，MVZ内仍可发现少数浅染的Fos阳性细胞，与Sham-NS组比较相差显著(P＜0.01)。腹腔注射LPS组动物(SDV-LPS组)，MVZ内Fos阳性细胞较Sham-LPS组明显减少(图2，4)，相差非常显著(P＜0.01)，AP内仍可见到Fos阳性细胞表达，但较Sham-LPS组AP内的Fos阳性细胞略有减少，相差不显著；Fos阳性细胞在MVZ内的分布较Sham-NS和SDV-NS组明显增加(P＜0.01)。SDV-LPS组MVZ内的Fos阳性细胞多数为浅染，两侧呈对称性分布，无侧别差异。从延髓尾吻方向看，Fos阳性细胞主要集中在延髓AP平面上，其他平面相对较少。横切面上看，Fos阳性细胞多集中分布于DMM内AP和mNTS,VLM和IRt内Fos阳性细胞相对较少。dmnX和nA内均未见Fos阳性细胞分布。

1假手术-LPS组动物MVZ背内侧部(DMM)内Fos阳性细胞(AP.最后区NTS.孤束核)。标尺示100μm

Fig.1 Fos posi