【摘要】目的构建反义GFAP逆转录病毒表达载体，评价其对培养正常及损伤星形胶质细胞(Ast)形态及GFAP基因表达的影响。方法用定向克隆技术，将1.1kb的GFAP基因片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN上，获得重组体PLBskG，经病毒包装、抗性克隆筛选、滴度测定等，挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩展培养，收获病毒上清液感染体外培养的Ast，通过免疫组织化学、原位杂交、RT-PCR、Southern blot和流式细胞仪分析等方法，研究PLBskG对正常及损伤Ast的生长、细胞增殖周期、细胞形态结构、GFAP基因表达的影响。结果插入PLBskG中的GFAPcDNA片段序列、方向完全正确，Southern杂交及RT-PCR分析表明，PLBskG成功整合入PA317细胞中，并实现了在NIH3T3细胞中的表达。PLBskG使正常及反应性Ast生长抑制，G1期阻滞，Ast胞体变圆、胞浆减少、突起变细、回缩，核浆比例增大。GFAP免疫组织化学染色减弱；GFAP mRNA表达水平降低。结论获得了构建正确的反义GFAP逆转录病毒表达载体，并证实其对正常及反应性Ast形态结构、GFAP表达水平等均有明显的影响，为深入研究Ast反应及GFAP基因的功能创造了条件。

【中图分类号】Q189【文献标识码】A

【文章编号】0529-1356(2000)02-102

THE CONSTRUCTION OF ANTISENSE GFAP RETROVIRUS

EXPRESSING VECTOR AND THE EFFECT ON ASTROCYTE

HUANG Qi-lin,ZHANG Ke-cheng

（Department of Neurosurgery,Xingqiao Hospital,）

CAI Wen-qin

（the Third Military Medical University,Chongqing 400037,China）

【Abstract】Objective To recombinant antisense GFAP retrovirus expressing vector and to investigate its effect on morphology and GFAP expression of normal,reactive astrocyte. Methods A 1.1kb from the coding region of mouse GFAP gene was cloned in the antisense orientation to PLXSN,a retrovirus vector.The recombinant expressing vector was named as PLBskG.The efficiency of PLBskG on the growth,cell cycle,morphology and GFAP gene expression of normal and reactive astrocyte in vitro was investigated by cell growth curve,flow cytometer immunocytochemistry,in situ hybridization,RT-PCR,Southern blot. Results The sequence and the orientation of GFAP cDNA fragment inserted into PLBskG was completely accuracy.The PLBskG was successfully conformed into PA317 cell and expressed in NIH3T3 cell as showed by Southern blot and RT-PCR analyze.The PLBskG infection resulted in growth suppression and G1 stage arrest of the normal and scratched astrocyte.The normal and reactive astrocytes infected by PLBskG became round or ellipse.The process of this cell became fine or retracted,the ratio of nuclei/cytoplasm was larger.The staining of GFAP substance was reduced and transcription level of GFAP mRNA was down-regulated. Conclusions We obtained a normal construction of the antisense GFAP retrovirus expressing vector,and confirmed that this vector could effectively inhibit the growth and GFAP expression of normal and reactive astrocyte in vitro.

【Key words】 Astrocyte;Retrovirus;Glial fibrillary acidic protein;Brain injury

星形胶质细胞(astrocyte,Ast)在中枢神经系统(CNS)中起着重要的作用，它不仅参与了CNS各种生理功能的调节，而且在CNS的多种病理变化中，尤其是在CNS的损伤修复中起着重要的作用。研究发现，胶原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)对维持Ast的形态结构及功能具有重要作用，抑制GFAP基因表达，可能影响Ast的生长、增殖，以及Ast对损伤的反应^［1］。反义核酸技术是目前人工干预基因表达的一项重要技术，它利用人工合成或重组的，与靶基因互补的一段反义DNA或RNA片段，特异性的与靶基因结合，达到封闭其表达的目的。本研究采用基因重组技术，成功构建了反义GFAP逆转录病毒表达载体，通过体外实验研究了其对培养正常及反应性Ast形态结构、GFAP基因表达的影响，并探讨了作用机制与意义。

材料和方法

1. 主要材料

内切酶SaⅡ、HindⅢ、EcoRI、XhoI及M-MLV逆转录酶为Promega公司产品，Lipofectin、G418、Dulbecco' modified Eagle medium(DMEM)为GIBCO公司产品，细胞系PA317、NIH3T3、ψ2为军事医学科学院贺福初研究员惠赠，胎牛血清为天津血制品研究所产品，TriPure试剂盒为宝灵曼公司产品，免疫组织化学与原位杂交试剂为中山公司产品。

2. 重组反义GFAP逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

质粒pBR322/GFAP(含GFAP基因第1外显子起始密码区1.1kb DNA片段，由美国纽约大学医学中心Nicholas J.Cowan教授惠赠，用Sal I和Hind Ⅲ双酶切后，回收目的片段，亚克隆至pBluscript sk-载体上，重组子命名为BskG。在插入位点的外侧，用EcoRI和XhoI双酶切BskG质粒，回收目的片段，反向插入逆转录病毒载体PLXSN上，重组子命名为PLBskG，酶切鉴定及序列分析。

3. 病毒包装与滴度测定

PLBskG及空载体PLXSN质粒用脂质体Lipofectin包裹后转染PA317细胞，G418筛选2周，随机挑选各4个克隆细胞扩增培养，收获病毒上清，感染NIH3T3细胞，G418筛选，根据克隆形成数，计算病毒滴度。挑选滴度高的克隆细胞继续扩增培养。收获的病毒上清，交叉感染ψ2及PA317细胞，重复两次，再次测定病毒滴度。

4. Southern杂交鉴定PLBskG在包装细胞中的整合

提取病毒感染的PA317细胞基因组DNA，酶切后，凝胶电泳分离，转NC膜，³²P-GFAPcDNA探针进行Southern杂交。

5. RT-PCR检测目的基因在NIH3T3细胞中的表达

用TriPure试剂盒提取PLBskG感染的NIH3T3细胞总RNA，经M-MLV逆转录酶反转录成cDNA后，PCR扩增，凝胶电泳分析。GFAP引物上游序列为：5′-CTGAATTCTGCTGGCTTCA-AGG-3′，下游序列：5′-CTAAGCTTGCTCTGCG-TTGCGG-3′，扩增片段增长624bp。β-actin引物上游序列为，5′-GCG-GGAAATCGTGCTGACATT-3′，下游序列为5′-GATGGAGTTGAAGGTAGT-TTCGTG，扩增片段长314bp。扩增条件：94℃,4min；接94℃,30s;60℃,1min;72℃,1min;循环30次后，接72℃,7min。

6. Ast分离培养

取新生当天Wistar大鼠皮层组织，制成细胞悬液。200目金属滤网过滤，收集滤液，转入培养瓶中，补加含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5%CO₂孵箱培养24h，细胞贴壁后换液。继续培养至约90%融合时，0.25%胰酶消化，传3～4代，纯化Ast培养。

7. 反应性Ast体外模型的建立

改良Yu^［2］等建立的体外培养Ast划伤模型，采用点搓法造成Ast损伤，即取24孔板，每孔中置有经多聚赖氨酸处理的盖玻片，Ast生长在经多聚赖氨酸处理的盖玻片上，达80%～90%融合后，用自制消毒橡皮头，无菌钳夹持后，在盖片的不同部位上轻轻点搓3～4次，制成体外Ast损伤模型。加D-Hank清洗1次，去除损伤碎片，补加新鲜培养基继续培养。

8. PLBskG感染靶细胞

取病毒上清1ml,滴加在50%～60%融合的培养Ast上，37℃,5%CO₂孵箱中孵育3h，补充含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养。

9. PCR扩增Neo基因鉴定PLBskG在靶细胞中的整合

提取PLBskG感染的培养Ast细胞基因组DNA，PCR扩增。反应条件：94℃，4min;接94℃,30s;60℃,1min;72℃,1min，循环30次后，接72℃,7min。Neo基因引物上游序列为5′-CGAGGCAGCGCGGCTATCGT-3′，下游序列为5′-ACGT-GCTCGCTCGA-TGCGAT-3′，扩增片段长度240bp。

10. RT-PCR检测靶细胞中GFAP mRNA基因的表达

提取PLBskG及PLXSN感染的正常Ast、划伤Ast细胞总RNA，经M-MLV反转录成cDNA后，PCR扩增。

11. 生长曲线测定

Ast按1×10⁵接种24孔板，长至60%融合后，弃培养基，每孔加病毒上清1ml,24h后，换含10%胎牛血清的新鲜培养液，分别于换液后0、1、3、5d，各取3孔细胞，胰酶消化后，收集细胞，台盼蓝染色，计数活细胞，取平均值，绘制生长曲线。

12. 生长周期检测

收集培养的正常Ast、划伤Ast及病毒感染后0、1、3、5d的细胞，碘化丙锭(propidium iodide,PI)染色，流式细胞仪检测。

13. 免疫细胞化学染色(ICC)

生长于盖玻片上的Ast，经70%酒精+10%冰醋酸固定30min后，按本室常规方法进行ICC染色^［3］