【摘要】目的研究Fas配体(Fas ligand, FasL)在移植免疫方面的作用，克隆其编码的全部cDNA序列，并添加Kozak序列，以便在真核细胞高效表达大鼠FasL。方法从大鼠的睾丸组织中提取总RNA，设计上、下游引物以RT-PCR的方法扩增出一931bp的DNA片段，将这一片段重组于pBK-RSV载体中，酶切鉴定插入片段正确后进行全序列分析。结果证实该研究所克隆的cDNA是编码正确的大鼠FasL基因，与发表于GeneBank上的序列相比，完全正确。已构建成用于真核表达的重组质粒pBK-RSV/rFasL。结论克隆到了编码正确的大鼠FasL的cDNA全序列，对移植免疫和帕金森病基因治疗的基础研究及临床应用具有重要意义。

【中图分类号】Q781；Q784【文献标识码】A

【文章编号】0529-1356(2000)02-177

THE CLONING OF FAS LIGAND GENE IN THE RAT

SUN Cheng-san ,YU En-hua,

（Department of Anatomy, Beijing Medical University, Beijing 100083;）

XU Qun-yuan，DUAN De-yi, YU Feng-shan

（Beijing Institute of Neuroscience, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100054,China）

【Abstract】Objective The cDNA fragment of rat Fas ligand with additional Kozak sequence was cloned in order to investigate the roles of FasL in gene therapy for transplant-immune and its expression in eukaryotic cells.Methods 100mg tissue of rat testis was used to extract total RNA, a 931bp positive DNA band was obtained by reverse transcription PCR(RT-PCR) method. The fragment was then cloned into the pBK-RSV vector and the insert was sequenced after analysis of the recombinant pBK-RSY plasmids by restriction enzymes.Results The DNA fragment of 931bp with additional Kozak sequence was amplified from reverse transcription mixture, and it proved to be correct compared with the sequence deposited in GeneBank(U03470). The recombinant eukaryotic expression plasmid(pBK-RSV/rFasL) was then constructed.Conclusions The full-length cDNA encoding FasL with additional Kozak sequence was harvested and can be expressed in eukaryotic cells.

【Key words】 Gene cloning;DNA Fas ligand; RT-PCR; Sequence analysis

FasL属肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)家族的成员之一，由于FasL能引起Fas阳性细胞发生程序性死亡，因此以前的研究主要集中在凋亡方面；近几年的研究有很多新的发现，如：FasL对免疫豁免器官免疫特权状态的产生和维持具有重要的意义^［1］；表达FasL的工程细胞及其重组腺病毒或逆转录病毒能使肿瘤细胞减少或消失^［2］；FasL还可以抑制胰岛^［3］、角膜^［4］等移植的排斥反应，延长移植物的存活时间。虽然大脑属免疫豁免器官，但这是相对的。一般来说，移植物特别是异体移植组织在脑内存活的时间并不长，这很可能与脑内的免疫排斥反应有关。因此，构建能表达FasL的工程细胞或重组病毒，将有可能克服神经移植的免疫反应，对神经变性疾病的移植治疗带来新的曙光，也能对肿瘤治疗提供新方法。虽然Suda等^［5］已克隆了大鼠的FasL基因，但用我们自己的材料重新克隆仍有必要，虽无产权，但是无使用上的问题，而且国内目前尚无人克隆，我们的基因可满足国内的需要。

材料和方法

1. 材料

1.1大鼠睾丸组织样品，取自SD大鼠，由北京医科大学动物部提供。

1.2引物设计：RT-PCR上游引物

TGA AT 3′(29mer)

RT-PCR下游引物

5′ACC GTC GAC ATA TTC CTG GCA TCC ATG AT3′(29mer)

5′端下划线者为BamH I或Sal I酶切位点，其前为保护碱基，方框内为Kozak序列。引物的设计参考GeneBank(U03470)发表的序列，用Oligo5.0软件帮助设计，由Sybersyn公司合成。

1.3菌株与质粒：菌株E coli JM109为本室冻存；穿梭质粒pBK-RSV(stratagen公司)

1.4主要试剂及工具酶：TRIZOL总RNA提取试剂，SUPERSCRIPT II 逆转录酶(GIBCO BRL)，Pfu DNA聚合酶，dNTPs、Oligo(dT₁₅)、T4 DNA连接酶(Promega)，核酸内切酶BamH I、Sal I、Sma I、BstX I(华美生物工程公司)、Cla I、Nde I(GIBCO BRL)，其他试剂为国产或进口分析纯试剂。

2. 方法

2.1总RNA的提取：参考试剂盒的说明，取100mg大鼠的睾丸组织，匀浆后进行总RNA的提取。

2.2逆转录反应：甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA，确定无降解后，进行以下逆转录反应：取RNA(2g/L)1μl，oligo(dT)₁₅(500g/L)1μl，无RNase水10μl，混合后70℃，10min；快速在冰上预冷，短暂离心后加入5×第1链缓冲液4μl，0.1mol/L DTT2μl,10mmol/L dNTPs(10 mmol/L each dATP、dGTP、dCTP、dTTP)1μl,42℃ 2min，加1μl SUPERSCRIPT Ⅱ， 42℃ 50min；70℃ 15min灭活逆转录酶，-20℃存放。

2.3PCR扩增：取10倍稀释的逆转录产物1μl，以FasL引物进行PCR反应。PCR条件为95℃ 50s，59℃ 30s，72℃ 2min，共30个循环。

2.4PCR产物的克隆：从琼脂糖凝胶上切下PCR产物，用DNA纯化回收试剂盒纯化回收，经T4多核苷酸激酶磷酸化后，和纯化的经Sma I酶切的真核表达载体pBK-RSV进行连接反应，16℃连接20h，转化E.coli， JM109，挑取白色菌落筛选重组质粒。

2.5酶切图谱及DNA序列分析：根据预期的酶切位点，进行酶切反应；酶切正确的克隆送北京六合通技术发展有限公司进行序列测定。

结果和讨论

1. PCR扩增产物及克隆

从大鼠睾丸组织提取的总RNA，用合成的大鼠FasL引物，经RT-PCR的方法，获得了长度在931bp的特异条带。纯化回收PCR产物，并克隆于pBK-RSV的Sma I位点，转化JM109感受态细菌，获得重组质粒。用BamH I/Sal I切出了约920bp左右的片段，用BamH I或Sal I单酶切，前者切出片段，而后者没切出，说明片段是反向插入的；同时，用片段内部的酶切位点Nde I或BstX I和Sal I也分别切出了预期的片段；同时，重组质粒经PCR扩增也获得了预期的片段，说明我们克隆的DNA片段可能是大鼠的FasL基因，并得到了带大鼠FasL基因的重组质粒pBK-RSV/rFasL。

2. 测序及真核表达质粒的重组

挑选阳性克隆经ABI PRISM377自动测序仪测序，证实我们克隆的基因长度为931bp，包含全部编码序列837bp，与GeneBank上的序列完全相同，根据序列分析结果，整理出编码大鼠FasL基因的全序列(附图)。

附图大鼠FasL基因的编码序列(横线部分为Kozak序列)

Figure The cDNA sequence encoding rat FasL (The part underlined is Kozak sequence)

将测序无误的重组质粒用BamH I/Cla I酶切，纯化回收920bp左右的片段；同时对空质粒pBK-RSV同样酶切；纯化回收并与前者进行定向连接反应，挑出白色的克隆；酶切鉴定无误后，大提质粒并纯化，用作真核表达及体内外实验。

3. 讨论

FasL/Fas系统属于TNF/TNF受体家族，它们的相互作用在调节凋亡介导的免疫系统方面起着枢纽作用。因此，其功能与提高移植、基因治疗和艾滋病(AIDS)治疗等效果有关。由于对这些领域的研究多以大鼠为动物模型，因此克隆大鼠的FasL基因有一定实际意义。

RT-PCR是克隆cDNA常用的方法，它的敏感性和特异性很高，可以从微量的mRNA逆转录扩增到特异性的目的片段，FasL在大鼠的角膜、睾丸和活化的T细胞都有大量的表达，因此，本研究用取材简单、mRNA丰度高的大鼠睾丸组织作为样品，实践证明，这是可行的。在引物设计方面，本实验的上游引物从起始密码子开始，下游引物从终止密码子下游约50个碱基处开始，这虽然增加了克隆片段的长度，但却防止了严重的二级结构的形成；上下游引物的GC含量通过合适的酶切位点和保护碱基，使它们的Tm值差别不大；引物中与模板互补的序列为20bp，这些措施都最大限度地提高了PCR产物的特异性。另外，在运作PCR时，运用热启动技术，使引物二聚体的产生降到最低限度。

本实验扩增到的特异性片段约为931bp，与预期片段大小相符；用带Lac Z的载体进行克隆，可用蓝白斑筛选，节省了时间；白色克隆经BamH I和/或Sal I以及片段内部的Nde I或BstX I进行酶解，初步鉴定为大鼠FasL cDNA。测序结果表明，该片<