【摘要】目的检测SA-30(sperm antigen-30)抗原在小鼠精子发生、成熟、获能及受精后的分布变化。方法免疫组织化学LSAB法。结果SA-30在小鼠睾丸内的各级生精上皮均有分布，尤其是靠近管腔的精子细胞染色最深；附睾各段的上皮细胞也有SA-30存在，而且主要集中在核上区；在附睾头和附睾尾的精子，SA-30主要分布在顶体区，两者无明显区别，获能后的精子除在顶体区有阳性染色外，尾部和顶体后区也出现了阳性反应。妊娠d3的小鼠胚泡表面有SA-30存在，而妊娠d6的胚胎上则未检测到SA-30。结论SA-30出现在小鼠精子发生的早期，附睾内精子成熟过程中，其表面SA-30的分布没有明显变化，而且在获能后仍然存在，早期小鼠胚上也有SA-30的分布，从而提示SA-30可能参与受精过程及早期胚胎的发育。

【中图分类号】Q954.4【文献标识码】A

【文章编号】0529-1356(2000)02-167

LOCALIZATION OF SA-30,A CON A-BINDING GLYCOPROTEIN,ON MOUSE TESTIS,EPIDIDYMIS,SPERMS AND EARLY EMBRYOS

SUN Bing-gui, ZHOU Zhan-xiang, DENG Ze-pei

（College of Veterinary Medicine,China Agricultural University,Beijing 100094,China）

【Abstract】Objective Understanding the distribution and changes of SA-30 during mouse spermatogenesis,maturation,capacitation and fertilization. Methods Immunohistochemistry was used. Results In testis,positive staining was found in the spermatogenic cells with a higher reactivity in the spermatids.In epididymis,the epithelia of caput,corpus and cauda epididymis were all stained,and the positive sites were mainly restricted to the superanuclear areas.On the smears of caput and cauda sperms,the acrosomal region was strongly stained,while the stainig on postacrosomal region was negative.After capacitation,however,the sperm tail and postacrosomal region were also stained.SA-30 was also found on early embryos on day 3 of pregnancy, but not on day 6 of pregnancy. Conclusions SA-30 begins to appear in the early stage of mouse spermatogenesis;SA-30 on sperm surface does not show apparent changes during epididymal maturation and does not loss during capacitation; SA-30 also occurs on early mouse embryos;SA-30 may be involved in fertilization and the development of early embryos.

【Key words】 Speim antigen-30; Immunohistochemistry; Mouse

在精子成熟、获能、顶体反应及精卵结合的过程中，精子表面的糖复合物起着重要作用^［1，2］。亲合细胞化学的结果表明，睾丸内精子生成过程中，精子表面有糖蛋白存在^［3］，在附睾内成熟及以后的获能过程中，精子表面糖蛋白的数量及分布均发生了改变^［4，5］。许多证据表明，多种动物精子表面有Con A结合糖蛋白的分布，但对其在精子成熟和获能时被修饰的认识还不尽一致^［4，6］。

在以前的研究中，我们发现小鼠及羊精子表面有多种糖复合物^［7，8］。另外，利用Con A-Sepharose 4B亲合层析结合Sephadex G-100的方法，从牛精子膜上分离了一种能和Con A结合的糖蛋白，因该糖蛋白的分子量为30kD，故称之为SA-30(sperm antigen-30)。用SA-30免疫新西兰雌兔，制备兔抗SA-30抗血清，利用该抗血清对SA-30在牛精子上的定位及其在获能与顶体反应过程中的变化进行了检测^［9］。最近的体外试验发现，兔抗SA-30抗血清能阻止小鼠精子与卵透明带的结合，而且对小鼠精子有制动作用(待发表)，提示SA-30在受精过程中起重要作用。本实验利用免疫组织化学的方法，对SA-30在小鼠睾丸、附睾、精子及早期胚胎上的分布进行了检测，以了解SA-30在精子发生、附睾内成熟、获能及受精后的变化，从而进一步认识SA-30的生物学意义。

材料和方法

1. 睾丸与附睾切片

成年雄性昆明系小鼠(购自中国科学院遗传所)5只，颈椎脱臼致死后迅速取睾丸和附睾，于改良的Bouin液(不加冰醋酸)中固定，Paraplast包埋剂包埋，制备5μm厚切片。

2. 精子样品

2.1附睾内的精子：成年雄性昆明系小鼠5只，颈椎脱臼致死后迅速摘除附睾，剪下附睾头和附睾尾，分别放入盛有0.01mol/L PBS(pH7.4)的培养皿中剪碎，于37℃静置10min，使精子游离出来，4层镜头纸过滤后，制备精子涂片。

2.2获能精子：同上操作取出附睾尾，于盛有PBS的培养皿中剪碎过滤后(PBS及所用器皿均在37℃预温后使用)，镜下调节精子密度为5×10⁷个/ml，用灭菌滴管吸取精子悬液，向发情期小鼠阴道注入(0.5ml/只)，进行人工授精，1.5h后处死小鼠，用PBS从子宫角冲洗获得子宫内的精子，精子悬液经4层镜头纸过滤后，制成精子涂片。

3. 早期鼠胚切片

成年昆明系小鼠按雌、雄3∶1的比例合笼，第2天清晨检查有阴栓者定为妊娠d0，于妊娠d3和d6各取5只，颈椎脱臼致死后迅速取出整个子宫，于改良的Bouin液中固定，Paraplast包埋剂包埋，制备5μm厚切片。

4. 免疫组织化学染色

切片经二甲苯脱蜡及系列酒精入水(精子涂片此步省略)，0.5%H₂O₂(无水甲醇配制)封闭内源性过氧化物酶，PBS洗5min，10%正常羊血清封闭后，加兔抗SA-30抗血清(自制，1∶20稀释)孵育(4℃过夜)，PBS洗涤后加生物素标记羊抗兔IgG(华美公司，1∶20)37℃温育30min，PBS冲洗，加链霉亲合素-HRP(Gibco,1∶200)37℃温育30min，PBS冲洗后用H₂O₂-DAB(Sigma)显色，常规封片。

阴性对照用正常兔血清代替兔抗SA-30抗血清。

结果

1. SA-30在小鼠睾丸及附睾的定位

1.1曲细精管：曲细精管内各级生精上皮均有抗SA-30抗血清的阳性染色，精原细胞和精母细胞的外周部分有抗SA-30抗血清的强阳性反应，胞核区阴性，但SA-30究竟是仅在膜上还是胞质中也有尚不能确定，需要超微水平的检测。靠近管腔的精子细胞，整个细胞均为强阳性染色(图1)。

1抗SA-30抗体在小鼠睾丸的标记。曲精小管内各级生精上皮均有阳性标记，尤其在精子细胞(↑)标记最强×100

Fig.1 Immunohistochemical staining with polyclonal antibody to SA-30 on mouse testis. ×100

1.2附睾：(1)附睾头睾丸输出管及附睾管上皮细胞的核上区有强阳性染色，基部稍弱，上皮细胞游离缘的静纤毛及管腔内的精子团也有阳性染色，精子头部较强(图2)。(2)附睾体附睾管上皮细胞变矮，阳性反应部位基本与附睾头相同，反应强度稍有减弱(图3)。(3)附睾尾附睾管上皮细胞变得更矮，阳性反应强度和阳性区域基本与附睾体相同(图4)。

2抗SA-30抗体在小鼠附睾头的标记×100

3抗SA-30抗体在小鼠附睾体的标记×100

4抗SA-30抗体在小鼠附睾尾的标记×100

Fig.2 Immunohistochemical staining with polyclonal antibody to SA-30 on mouse caput epididymis. ×100

Fig.3 Immunohistochemical staining with polyclonal antibody to SA-30 on mouse corpus epididymis. ×100

Fig.4 Immunohistochemical staining with polyclonal antibody to SA-30 on mouse capuda epididymis. ×100

2. SA-30在小鼠精子的定位

2.1附睾头精子：精子顶体区呈强阳性染色，尾部的胞质小体也有阳性染色，而顶体后区和尾部为阴性(图5)。

5抗SA-30抗体在小鼠附睾头精子上的标记×500

Fig.5 Immunohistochemical staining with polyclonal antibody to SA-30 on mouse sperms of caput. ×500

2.2附睾尾精子：阳性部位及阳性反应强度基本与附睾头精子相同(图6)。