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分类号：R322.85文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-8
THE SYNAPTIC NUMERICAL DENSITY COUNTING BASED ON
DISECTOR TECHNIQUE AND ITS COMPUTER-AIDED ANALYSIS
ZHANG Lin
(Department of Anatomy,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
MAI Hong-yan
(Department of Anatomy,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
HUANG Hao
(Department of Mechanics and Engineering Science,Peking University,Beijing 100871,China)
LIU He-fei
(Department of Mechanics and Engineering Science,Peking University,Beijing 100871,China)
NAN Yan
(Department of Anatomy,Beijing Medical University,Beijing100083,China)
SHANG Jun-jie
(Department of Mechanics and Engineering Science,Peking University,Beijing 100871,China)
LIAO Hong-en
(Department of Mechanics and Engineering Science,Peking University,Beijing 100871,China)
YU En-hua
(Department of Anatomy,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
SHEN Li
(Department of Anatomy,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
Abstract：ObjectiveWe developed a quantitative method based on the Disector technique to count the synaptic numerical density and implemented the computer-aided analysis on it with the Visual Basic.MethodsThe neuropils on the same vertical axes were observed and recorded with the serial ultrathin section technique as well as transmission electron microscopy.The adjacent parallel electron micrographs of known distance apart were selected to make up the Physical Disector,and the synaptic numerical density was counted according to the Disector principle.The computer-aided analysis system for synaptic numerical density based on the Disector technique(DisectorCountor 1.0) was developed on the Windows95 system with the Visual Basic 4.0.ResultsThere was no significant statistical difference (P＞0.05) between the result by hand and that with Disector Countor 1.0.ConclusionWith the advantage of being highly objective and efficient,the computer-aided analysis system for synaptic numerical density based on the Disector technique,Disector Countor 1.0,would be the developmental direction for synaptic numerical density analysis.
Key words：Synapse;Numerical density;Stereology;Disector technique;Computer software▲
突触的数目在神经系统的发育与衰老、损伤与修复、可塑性与学习记忆等生理病理过程中具有明显变化，准确计数神经组织中突触的数目是神经生物学研究方法亟待解决的难题［1，2］。体视学技术是应用数学方法对固体组织的剖面进行空间解释和估算的方法。Disector技术是一种利用若干组相邻平行二维剖面计数三维空间中任意形状粒子数目的体视学方法，具有计数效率高、无偏差等优点，是80年代以来空间粒子计数技术领域的重大突破［3，4］。计算机辅助生物图像分析技术是在生物学、计算数学和计算机数值分析技术等学科基础上形成的交叉学科，已广泛应用于生物图像的定量分析［5，6］。我们利用本文探讨应用Disector技术测量突触数密度的可行性和具体步骤，以及基于该技术的突触数密度计算机辅助分析的原理和过程。
材料和方法
1.突触数密度Disector测量法的建立
1.1组织包埋块的制备：30d龄Wistar大鼠3只。复合麻醉剂腹腔麻醉，左心室插管，37℃生理盐水50ml快速冲洗，4℃含2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1mol/L PBS(pH 7.4)250ml灌注，持续30min。开颅取脑。4℃含3%戊二醛的0.1mol/L PBS(pH7.4)后固定4h。0.18mol/L蔗糖冲洗液(4℃)冲洗3次，4℃冰箱过夜。次日，振动切片机额状切片，片厚50μm。每只动物从海马完整的厚片中随机抽取5～10片。1%锇酸固定1h(4℃)。618环氧树脂平板包埋。
1.2连续超薄切片的制备：每只动物从平板包埋的厚片中随机抽取1片，解剖显微镜下取CA1区，切取半薄切片，1%甲苯胺蓝染色，依据半薄切片定位修块。超薄切片机连续超薄切片，每1厚片选取2～3条由6～10片连续超薄切片构成的切片带，裱于独眼铜网。醋酸铀-枸橼酸铅双重染色。
1.3电镜摄片的方法：每只动物从切片带中随机选取1条，TM100X-Ⅱ透射电镜下观察摄片。选取切片带的第1张切片，1 400倍下，寻找锥体细胞的胞体的位置，确定海马辐射层的位置和范围，在该范围内随机选取1个仅由1个内皮细胞构成的毛细血管。在该毛细血管周围随机选取神经毡，7 200倍下摄片。选取第2张切片，1 400倍下，寻找定位的毛细血管，并以此确定与上一拍摄视野在同一纵轴上的视野(即相邻视野)，7 200倍下摄片。同样方法依次观察并拍摄剩余切片，每条切片带摄片5～9张。
1.4Disector法与突触数密度的测量：Disector是由两个间距为h的平行平面构成的三维测试系统，其中1个平面称为计数平面(reference plane)，上覆Gundersen测试系统，用于确定测试范围和计数待测粒子的截面数；另一平面称为核查平面(look-up plane)用于核查两个平面间待测粒子截面数的差别［4，7，8］。其中粒子截面数的计数应遵循Gundersen法则：(1)落在测试系统内的粒子为有效粒子；(2)仅与包容线(即图1中覆盖在计数切片上测试框的虚线)相交的粒子为有效粒子；(3)凡与排斥线(即图1中覆盖在计数切片上测试框的实线)相交，无论是否与包容线相交均为无效粒子［9］。在测量突触数目时，利用相邻两张电镜切片代替Disector的两个平行平面，分别称为计数切片和核查切片，即Physical disector技术(如图1)。若切片厚度为t,则h=t。
图1Physical Disector的模式图
Fig.1The illustration of the Physical Disector
超薄切片的照片光学放大3倍，依次抽取相邻的两张，选定测试框的面积为7.23×106nm2。首先在两张照片上描出较粗大轴突的轮廓，作为定位标记。然后在计数切片(两张切片中的任何1张)中计数突触的截面数，突触计数标准为：(1)在突触前成分中存在3个以上突触小泡；(2)在突触后成分中可辨认出突触后致密物［10］。最后在核查切片中计数同时出现在计数切片和核查切片上的突触的截面数；两者之差为计数切片上出现而核查切片上不出现的突触的截面数Q-，也就是相应计数空间(测试面的面积A乘以两测试面的间距t)内突触的数目(详细数学推导参见参考文献［7］)，因此：
(*)
其中：Nv:突触的数密度；Q-：为计数切片上出现而核查切片上不出现的突触的截面数；t:超薄切片的厚度；A：测试面的面积。
1.5微皱折法与超薄切片厚度的测量：超薄切片在捞片时可形成两种皱折，一种是宽窄不定的大皱折，另一种是宽度恰好为切片厚度2倍的微皱折(small fold)［11］(图2)。微皱折在电镜下具有以下特征：皱折为两条紧密相贴的黑线；两黑线间有时可见1条极细、不连续的致密黑线(图3)系由染液渗入皱折间的缝隙中所形成；皱折的末端常可见分岔(图4)。48 000倍下，拍摄若干微皱折，测量它们的宽度，计算超薄切片的厚度为：42±5nm。
