摘要：目的研究大鼠表皮细胞的增殖活性是否随肾上腺素浓度而变化。方法利用核仁组织者区银染法(AgNOR)配合图像分析观察了肾上腺素浓度在10^-10mol/L～10^-6mol/L范围内培养的大鼠表皮细胞增殖活性的变化。结果在上述浓度范围内，肾上腺素可明显抑制培养大鼠表皮细胞的增殖活性；分析了单位面积细胞核上染色颗粒的面积(A_A)和单位面积细胞核上染色颗粒的数目(N_A)，与对照相比，P＜0.01。参数A_A在肾上腺素浓度为10^-8mol/L处为最低值。结论肾上腺素在10^-10mol/L～10^-6mol/L范围内可明显抑制培养大鼠表皮细胞的增殖活性，以10^-8mol/L的肾上腺素抑制作用最强。

分类号：Q253文献标识码：A

文章编号：0529-1356(2000)01-39

EFFECT OF EPINEPHRINE ON PROLIFERATION OF

CULTURED RAT EPIDERMAL CELLS

HUO Zheng-hao

(Department of Biophysics, Beijing Medical University, Beijing 100083,China)

FAN Jing-yu

(Department of Biology, Ningxia Medical Colloge,Yinchuan 750004,China)

Abstract：ObjectiveTo study if variation of epinephrine concentration will result in the alteration in proliferation activity of rat epidermal cells. MethodsUsing silver-staining technique for nucleolar organizer regions(AgNOR) in conjunction with image to analyse the alteration in proliferation activity of cultured rat epidermal cells in the presence of epinephrine at the concentration between 10^-10 mol/L-10^-6mol/L ResultsAt the concentrations examined epinephrine inhibited the proliferation activity of rat epidermal cells significantly. Two parameters were estimated, i.e., the area of staining granules per unit area of nucleus profile(A_A) and the number of staining granules per unit area of nucleus profile(NA), and both resulted in the same consequence:in comparison with control, P＜0.01, as indicated by t-test. The lowest value of A_A was observed at 10^-8mol/L of epinephrine concentration. ConclusionThe epinephrine at the concentration of 10^-10mol/L to 10^-6mol/L can inhibit the proliferation activity of cultured rat epidermal cells significantly, and the epinephrine of 10^-8 mol/L exhibited the highest inhibition effect.

Key words：Epidermal cell; Proliferation; Epinephrine; AgNOR▲

我们曾报道，大鼠表皮细胞的分裂活性随体表部位而异，并设想皮肤局部肾上腺素浓度不同可能是造成这种差异的一个重要原因^［1］。为进一步检验这一设想，我们用核仁组织者区银染法(silver-staining technique for nucleolar organizer regions, AgNOR)研究了肾上腺素在不同浓度下对培养大鼠表皮细胞分裂活性的影响。

材料和方法

1. 材料

1.1动物：Wistar大鼠，出生24h以内，雌、雄不拘，北京医科大学实验动物部提供。

1.2试剂：DMEM与新生牛血清(Gibco公司)；肾上腺素(酒石酸氢盐)与明胶(Sigma公司)；胰蛋白酶(华美公司)；其余试剂均为分析纯。鼠尾胶原自制^［2］。

2. 方法

2.1表皮细胞的原代培养与纯化：取经消毒后的乳鼠皮肤，剪至1mm³大小，均匀贴附于培养瓶底面，翻转培养瓶，加入适量DMEM培养液(内含25%新生牛血清，100IU/ml青霉素和100mg/L链霉素，pH6.8～7.0)，在37℃，5%CO₂培养箱内静置3～4h后，轻轻翻转平放，继续培养。当表皮细胞集落之间的成纤维细胞尚未汇合时，用0.25%胰蛋白酶消化，并在显微镜下观察，至成纤维细胞变圆后，加入含血清的DEME终止消化，轻轻吹打，移除消化液，用PBS洗2次，加入含25%新生牛血清的DMEM继续培养。5～6d后，仍混有部分成纤维细胞的表皮细胞生长成片，再用0.25%胰蛋白酶消化，消化后的细胞悬液接种于未铺胶原的培养瓶中，静止30min，在光镜下观察，见部分细胞贴壁稍加振荡也不浮起时，将培养液连同尚未贴壁的细胞一起移至铺有鼠尾胶原的培养瓶中继续培养。此步骤可重复，直至将成纤维细胞除净为止。

2.2生长曲线：纯化后的表皮细胞以5×10⁵／ml，2×10⁵／ml和0.5×10⁵／ml的浓度分别接种于24孔板中，从次日起每天同一时间消化其中4孔，计数细胞，连续7d，作出生长曲线。

2.3分裂指数：取对数生长期细胞消化，以2×10⁵／ml浓度接种于放有盖玻片的24孔板中。每日同一时间取3孔中的细胞，连续7d。细胞经10%中性福尔马林固定，常规HE染色，在细胞密度近似区，观察5 000个细胞，记录其中处于中期分裂象的细胞数。

2.4肾上腺素对表皮细胞增殖活性的影响：取对数生长期细胞，以2×10⁵ml浓度接种于放有盖玻片的24孔板中培养。24h后换为含1%新生牛血清的DMEM，使细胞饥饿24h。之后，移除孔中培养液，加入含不同浓度肾上腺素和20%新生牛血清的DMEM，继续培养。处理的肾上腺素浓度分别为10^-10mol/L，10^-9mol/L，10^-8mol/L，10^-7mol/L和10^-6mol/L。肾上腺素各浓度组的细胞均为3孔。对照组不加肾上腺素。培养12h后，取出盖玻片，用95%乙醇固定30min，并进行AgNOR染色。

2.5AgNOR染色方法及结果分析：经95%乙醇固定的细胞用双蒸水清洗3～4次，每次10min；进入酸化液，孵育5min；除去酸化液，用双蒸水洗3次，方法同上。在暗室内进入AgNOR染液，于20℃孵育30min。用水充分清洗后，再经显影，定影，按常规进行脱水，透明和封片。某些样品不经定影。酸化液内含冰醋酸和无水乙醇，其体积比为1∶3。AgNOR染液由a,b两种原液配成。a液：0.2g明胶溶于5 ml 2%甲酸中；b液：50%硝酸银水溶液。使用前将a与b液按1∶2的体积比混和，过滤。染色后的细胞在图像分析仪(Leica Q550-IW)上进行分析，分析的参数为单位面积细胞核上染色颗粒的面积(A_A)和单位面积细胞核上染色颗粒的数目(N_A)。每一肾上腺素浓度分析的细胞来自3个不同的孔，每孔观测最先进入视野的细胞30～40个。观测时，显微镜放大倍数为1 000，监视器上的最终放大为4 000倍。

2.6扫描电镜方法：生长于盖玻片上的细胞用2%戊二醛在4℃固定2h后，按常规脱水，临界点干燥，镀膜。在Hitachi S-450电镜下观察。

结果

1. 表皮细胞的原代培养及纯化与传代

组织培养2d后，有零星成纤维细胞长出，4～5d时，可见组织块周围长出1圈上皮样细胞。细胞呈多边形，鹅卵石路面状排列。其外周为成纤维细胞，呈长梭形，束状或火焰状排列(图1)。为获得纯化的表皮细胞，在组织块间的成纤维细胞尚未长满时，用0.25%胰蛋白酶消化，并按2.1节中所述方法进行纯化。图2是胰蛋白酶消化后成纤维细胞从与表皮细胞集落交界处脱落的情形；图3和图4分别是纯化后的表皮细胞的光镜和电镜照片。可见表皮细胞呈多边形，光镜下细胞核大而圆，常见数个核仁；在扫描电镜下，细胞表面有丰富的突起，边缘伸出短的伪足。纯化的表皮细胞传代后聚集成小岛状集落，然后从其边缘逐渐扩展成片。传至第6～7代后，细胞变大，胞质内颗粒增多，生长缓慢，终至死亡。

图1大鼠表皮细胞的原代培养。虚线右下方为为表皮细胞（↑）左上方为成纤维细胞（↑）．标尺示100μm

Fig.1Primary culture of rat epidermal cells.Right bottom:epidermal cells(↑);Top left:fibroblasts(↑).Bar=100μm

图2经胰蛋白酶消化后的原代培养的大鼠表皮细胞.虚线右下方为表皮细胞(↑),左上方的成纤维细胞已被消化掉.标尺示100μm

Fig.2Primary culture of rat epiderma cells after digestion by trypsin.Right bottom:epidermal cells(↑).The fibroblastsb originally located on the top left were eliminated by trypsin digestion.Bar=100μm

图3纯化后大鼠表皮细胞(↑)的光镜照片.标尺示100μm