摘要：目的研究人食管癌细胞株EC1和EC18的核基质形态及蛋白成分。方法应用细胞的选择性抽提、DGD包埋-去包埋剂电镜制样观察核基质形态，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向电泳和免疫印迹等分析核基质蛋白成分。结果抽提后，两种细胞内均存在精细的核基质-核纤层-中间丝网架。低分化的EC1细胞核基质较高分化的EC18更细密。核基质蛋白电泳显示，两株细胞有数种相同的核基质蛋白成分，也有各自的特异性核基质蛋白。在免疫印迹分析中，使用抗人NuMA单克隆抗体检测到两株食管癌细胞中都存在NuMA蛋白。结论在食管癌细胞中，存在特异的核基质蛋白，核基质-核纤层-中间丝形成一个连续的体系，对维持细胞核的完整性和细胞功能起重要作用。

分类号：R735.1；Q279文献标识码：A

文章编号：0529-1356(2000)01-65

THE NUCLEAR MATRIX IN HUMAN ESOPHAGEAL

CARCINOMA CELLS

CHEN Hai-bin

(Department of Histology and Embryology,Shantou University Medical College,Shantou 515031,China)

QIU Yin-qing

(Department of Anatomy,The Chinese University of Hong Kong,HongKong)

ZHANG Jin-kun

(Department of Histology and Embryology,Shantou University Medical College,Shantou 515031,China)

CHEN Ling

(Department of Histology and Embryology,Shantou University Medical College,Shantou 515031,China)

REN Xian-hui

(Department of Anatomy,The Chinese University of Hong Kong,HongKong)

YANG Lei

(Department of Anatomy,The Chinese University of Hong Kong,HongKong)

Abstract：ObjectiveTo investigate the nuclear matrix in two human esophageal carcinoma cell lines EC1 and EC18.MethodsThe fine structures of nuclear matrix were observed by DGD(diethylene glycol distearate) embeddment-free sections and the electrophoretic pattern of the nuclear matrix proteins was compared by SDS-PAGE,two-dimensional PAGE and Western blot analysis.ResultsThe nuclear matrix-lamina-intermediate filament fine network remained after selective extraction.The nuclear matrix of the less differentiated EC1 cells was much thinner and denser than that of the more differentiated EC18.Both cell lines shared myriad common nuclear matrix proteins,but cell line specific nuclear matrix proteins was detected.Western blot analysis with anti-NuMA revealed that nuclear mitotic apparatus protein presented in nuclear matrix proteins of two cell lines.ConclusionThere are esophageal carcinoma cell specific nuclear matrix proteins and the nuclear matrix-lamina-intermediate filament forms a continuous system which plays an important role in the maintenance of the nuclear integrity and cellular function.

Key words：Nuclear matrix; Esophageal carcinoma cells; Morphology; Electrophoresis▲

核基质是细胞核内非染色质蛋白的纤维网架，真核细胞在用非离子去垢剂、核酸酶和高盐溶液处理后，核内残留成分的98%以上为蛋白质，此外还有少量RNA和DNA。核基质构成细胞核的三维网架体系，在DNA复制、特异基因转录、RNA修饰、染色质包装、染色体形成和松解以及细胞分裂和分化等细胞生命活动中起重要作用^［1］。在肿瘤形成中，特殊基因的活化和表达与核基质蛋白组成的变化息息相关。有研究表明，人体肿瘤的发生、发展过程伴随着核基质蛋白的特异性改变^［2～5］，探讨肿瘤细胞核基质蛋白的改变，不仅有利于寻找肿瘤标志物，也有助于阐明肿瘤活性基因表达调控机理。本研究应用细胞的选择性抽提二硬脂酸二甘酯(diethylene glycol distearate，DGD)包埋-去包埋剂电镜制样、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、双向电泳和免疫印迹分析，观察比较了人食管癌细胞株EC1和EC18的核基质。

材料和方法

1. 细胞及其培养

人食管癌细胞株EC1和EC18由香港中文大学分别从食管低分化鳞癌和高分化鳞癌手术标本建立。本实验所用EC1是传代至63～67代之间的细胞，EC18是传代至69～72代之间的细胞。两种细胞均培养于含10%胎牛血清，100IU/ml青霉素，100mg/L链霉素的RPMI 1640中，置5% CO₂，37℃培养箱内，传代时用胰蛋白酶消化。

2. 核基质抽提

参照Yang^［6］的方法，收获培养的EC1、EC18细胞经DPBS洗涤后，再置于CSK缓冲液(100mmol/L KCl,3mmol/L MgCl₂,1mmol/L EGTA,1.2mmol/L苯甲基磺酰氟，10mmol/L PIPES pH6.8,300mmol/L Sucrose,0.5% Triton X-100,4mmol/L 氧钒核苷复合物)中4℃处理15min，离心沉淀后，用RSB缓冲液(42.5mmol/L Tris-HCl,8.5mmol/L NaCl,2.6mmol/L MgCl₂,1.2mmol/L苯甲基磺酰氟，1%Tween 40,0.5%脱氧胆酸钠，2mmol/L氧钒核苷复合物)悬浮沉淀细胞，4℃作用10min，离心后再用DB溶液(基本成分与CSK缓冲液相同，仅以50mmol/L NaCl代替100mml/L KCl)悬浮细胞并加入200mg/L DNaseⅠ室温消化30min，然后加入冷的2mmol/L(NH₄)₂SO₄，使其终浓度为0.25mmol/L,取离心淀淀物，用于电镜样品制备。

3. DGD包埋-去包埋剂电镜样品制备

抽提后的标本用2.5%戊二醛-CSK溶液4℃固定1h，1%锇酸固定30min，系列乙醇脱水，正丁醇过渡，DGD浸透包埋，切片，厚0.2μm，置镍网上干燥，在室温正丁醇中溶去包埋剂，然后由乙醇经系列Freon 13置换到纯Freon 13中，临界点干燥后，不经染色，直接用HITACHI H-7100型电子显微镜75kV观察。

4. SDS-PAGE及双向电泳分析

肿瘤细胞经选择性抽提后制备的样品溶解在蛋白溶解缓冲液中(8mol/L尿素，20mmol/L吗啉乙烷磺酸，1mmol/L EGTA,0.1mmol/L MgCl₂,1mmol/L苯甲基磺酰氟，1% β-疏基乙醇)，通过透析缓冲液(150mmol/L KCl,25mmol/L 盐酸咪唑，5mmol/L MgCl₂,2mmol/L DDT,0.125mmol/L EGTA,0.2mmol/L苯甲基磺酰氟)4℃透析过夜和低温超速离心去除中间纤维，获得的核基质蛋白溶解于样品缓冲液中，按常规方法进行SDS-PAGE。分离胶浓度为10%，150V恒压电泳1.5h。双向电泳时，先用Bio-Rad微型等电聚焦电泳装置进行第1向电泳，等电聚焦的pH梯度为3～10，电泳7 000伏特小时，等电聚焦电泳后的样品按SDS-PAGE的方法进行第2向电泳。上述电泳样品均银染后观察。

5. 免疫印迹分析

EC1、EC18细胞的核基质蛋白经SDS-PAGE电泳后，在100V，4℃，1h的条件下，电转移至硝酸纤维素膜上，用TBS洗涤后，置含5%脱脂奶粉的TBS中室温封闭1h，加鼠抗入NuMA蛋白(nuclear mitotic apparatus protein)单克隆抗体(1∶1 000稀释，DBS产品)，室温孵育2h;HRP标记的抗鼠IgG室温孵育1h，DAB-H₂O₂溶液显色。

结果

1. 食管癌细胞核基质-核纤层-中间丝的形态结构

电镜下观察，EC1和EC18细胞均存在精细发达的核基质-核纤层-中间丝结构体系。核基质网络基本上由纤维结构和许多附着在纤维上的致密颗粒组成。纤维粗细相似，均匀地遍布于整个细胞核中，致密颗粒大小不一。核纤层连续包绕细胞核，呈片状结构，向内与核基质纤维连接，向外与细胞质内的中间丝连接。中间丝分布于细胞质中，呈索状结构(图1，2)。EC1的核基质与EC18相比，纤维更加细密(图3，4)。此外，有些细胞核内尚可看到核仁基质，也是由纤维样结构和颗粒样结构组成，纤维聚集成团，比核基质更加致密，周围与核基质纤维相连(图5)。

图1EC1细胞的核基质(n)-核纤层(l)-中间丝(f)体系透射电镜图，DGD包埋切片。×4 000

Fig.1The muclear matrix(n)-lamina(l)-intermediate filament(f) of EC1 cells under TEM, DGD embedded section.×4 000

图2EC1细胞的核基质透射电镜图，DGD包埋切片。×30 000

Fig.2The nuclear matrix of EC1 cells under TEM,DGD embeded section.×30 000

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