摘要：目的探讨局灶性脑缺血后组织型纤溶酶原激活物(tPA)基因的表达及其与细胞凋亡的关系。方法用原位杂交和免疫组织化学方法检测tPA基因在大鼠局灶性脑缺血(大脑中动脉阻塞)后的表达，用TUNEL法检测缺血不同时间的细胞凋亡状况。结果脑缺血6h缺血中心部位的胶质细胞和梗死灶周边缺血半影区的神经元均观察到tPA免疫反应性信号，在大脑皮层后肢体区、顶皮层区、海马区和齿状回可见凋亡细胞，但缺血18h缺血侧神经元及胶质细胞未见tPA免疫反应性信号，仅齿状回有凋亡细胞。结论tPA蛋白在脑缺血6h缺血侧表达增高，局灶性脑缺血后神经元死亡有细胞凋亡的参与，该凋亡可能与tPA基因表达和缺血时间有一定关联。

分类号：Q344⁺.13； Q255文献标识码：A

文章编号：0529-1356(2000)01-13

EXPRESSION OF tPA GENE AND CELL APOPTOSIS FOLLOWING

FOCAL CEREBRAL ISCHEMIA IN RAT

PAN Yong

(Department of Pharmacology)

ZHENG Su-qiu

(Department of Pharmacology)

XIE Mian

(Department of Anatomy,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089;China)

XIE Yuan-yun

(Department of Anatomy,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089;China)

LIN Yi-li

(Department of Anatomy,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089;China)

YAN Guang-mei

(Department of Pharmacology)

Abstract：ObjectiveTo study the expression of tissue plasminogen activator(tPA) gene and the relationship with cell apoptosis following focal cerebral ischemia in rat.MethodsThe samples of focal cerebral ischemia(middle cerebral artery occlusion,MCA occlusion) were analyzed by using in situ hybridization (ISH) and immunohistochemical(IHC) methods.Apoptotic neurons were detected by using TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL).ResultsIn the rats 6h after MCA occlusion,posititive immunostaining of tPA was detected in endothelial cells of small blood vessels,meninges,chorioid,in the glial cells at the zone of ischemic core and neurons at the infarct border zone,apoptotic cells were observed in parietal and hindlimb cerebral cortex,hippocumpus and dentate gyrus,but in the rats 18h after MCA occlusion,immunoreactivity of tPA was not detected in the neurons and glial cells of the ischemic hemisphere,and apoptotic cells were only found in dentate gyrus.ConclusionsExpression of tPA protein in ischemic site 6h after MCA occlusion is higher than that of nonischemic site.Cell apoptosis was involved in neuronal death following focal cerebral ischemia,and the apoptosis might be related with expression of tPA gene and the time after cerebral ischemia.

Key words：tPA;Ischemia;Expression;Gene▲

缺血性脑损伤神经元死亡的方式主要有坏死和凋亡两种不同的机制。近年研究表明，细胞凋亡与多种丝氨酸(Ser)蛋白酶及其抑制物有关^［1，2］。组织型纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,tPA)是一种Ser蛋白酶，能催化无活性的纤溶酶原转变成有活性的纤溶酶，使血栓溶解。tPA也是脑内主要的纤溶酶原激活物^［3］，它在神经组织的异常表达与神经元退变和某些神经系统疾病有关^［4，5］。但tPA通过何种途径引起中枢神经元退化?尚不清楚。国内未见类似报道。鉴于临床可能广泛应用tPA治疗中风患者，我们研究了脑缺血后tPA基因的表达及其是否涉及脑缺血后的神经元死亡，为进一步研究脑缺血后神经元损伤的分子机制及寻求有效的临床防治提供科学依据。

材料和方法

1.主要实验仪器及试剂

TTC(Sigma公司，美国)、DIG寡核苷酸尾部标记试剂盒、DIG检测试剂盒和POD原位死亡检测试剂盒(宝灵曼公司，德国)，PAM-tPA单克隆抗体(Diamercan公司，美国)，SP免疫组织化学试剂盒(迈新公司，进口分装，广州)，UVP-GDS 8000凝胶成像系统(英国)。

2.制备鼠局灶性脑缺血模型

采用中山医科大学实验动物中心提供的健康Sprague-Dawley大鼠，雄性，230～300g，随机分为两组：缺血组和正常对照组。缺血组采用线栓法制备鼠右侧大脑中动脉阻塞模型^［6］。先用1%戊巴比妥钠(40mg/kg)将鼠麻醉后仰卧位固定于手术台上，经颈正中切口分离暴露右侧颈总动脉，在颈总动脉分叉处插入栓子(直径约为0.15mm的尼龙线)，栓子前端到达颈内动脉及远端，阻断大脑中动脉的血流。术后约1h实验鼠苏醒，出现左前肢屈曲和前进时向左侧划圈，证明右侧大脑中动脉阻塞成功。实验鼠按处死时间又分为6h(n=6)和18h(n=6)。用2%氯化三本四氮唑(TTC)染色以证实脑缺血灶的存在，冰冻切片或蜡片用于原位杂交、免疫组织化学和细胞凋亡检测。

3.原位杂交

3.1探针合成：根据带有tPAcDNA序列的P^GEM-1质粒图谱设计tPA探针，其序列为：GAT GCC CTG GCC CTG GAA GCA GGT TGC TCT GGT ATG TAT ACT由上海申工生物公司合成。

3.2探针标记：按DIG寡核苷酸尾部标记试剂盒指示进行标记。

3.3ISH(参照文献［7］)：将鼠冰冻冠状切片，片厚20μm，预处理后与DIG标记的寡核苷酸探针42℃杂交(50μl杂交液/片，探针浓度300μg/L)12～16h。清洗后在1∶4 000碱性磷酸酶标记的DIG抗体中温育40min，加入NBT和BCIP显色液室温避光染色3h，用PBS缓冲液终止反应，核固红复染。取正常鼠肾冰片作为阳性对照。

4.免疫组织化学SP法^［8］

蜡片脱蜡和水化后，加50μl过氧化物酶阻断液；PBS冲洗；再加50μl非免疫性动物血清室温孵育20min;PBS冲洗；加PAM-3tPA单抗室温孵育1h;再加生物素结合的二抗，室温孵育30min；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液孵育30min。DAB染色，自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封片。阴性对照用正常羊血清取代第一抗体，其余步骤同上。

5.TUNEL(TdT介导dUTP-X末端标记)染色

按原位死亡检测试剂盒指示进行。蜡片脱水后，经蛋白酶K处理后在TdT(末端脱氧核苷酰转移酶)与荧光素连接的核苷酸混合液37℃孵育45min，PBS冲洗两次，再加HRP连接的抗荧光素抗体，37℃温育60min。DAB显色，核快红复染，封片，镜下分析。阴性对照不加TdT。

结果

1.形态学观察

TTC染色显示正常鼠脑组织着深红色，梗塞灶为苍白色，位于右侧额、顶、颞叶皮层(图1)。TTC染色蜡片显示缺血灶位于大脑皮层后肢体区、顶皮层区和基底节区(图2)。HE染色缺血区许多细胞嗜伊红，细胞核固缩深染，核仁消失，胞浆疏松，染色变浅，细胞水肿，边界不清，有变性和坏死发生。缺血18h皮层变性坏死较6h更为明显。对照组无梗塞灶的出现。

图1局灶性脑缺血6h,TTC染色显示正常鼠脑组织着深红色(a)，缺血侧为苍白色(b)

Fig.1In rat brain at 6h after MCA occlusion by TTC saining .normal ischemic site is pink(a),ischemic site is pale(b).

图2TTC染色局灶性脑缺血6h脑片，表明缺血灶位于大脑皮层后肢体区、顶皮层区和基底节区

Fig.2In coronal section of central nervous system in rats at 6h after MCA occlusion .Ischemic region lies to parietal and hindlimb cerebral cortex,basal ganglia by TTC saining.

2.tPAmRNA的表达

原位杂交除极少数毛细血管呈现紫蓝色阳性信号外，在鼠脑组织均未见阳性信号。鉴于对照肾冰片ISH显示部分阳性信号，本实验用非放射性ISH在脑组织未检测到tPA阳性杂交信号，可能与其表达量太低有关，与Kittaka等^［9］的报道类似。

3.tPA蛋白的分布

免疫反应性细胞呈棕色，清晰可见，背景呈淡灰色。局灶性脑缺血6h脑片在脑膜、脉络