摘要：目的探讨甘氨酸能神经元(Gly-ir)在大脑皮层内的分布及特征。方法用免疫组织化学与免疫电镜方法，在光镜与电镜水平观察甘氨酸免疫反应性神经元在大鼠运动皮层内的分布及其超微结构特征。结果甘氨酸免疫反应性神经元均为非锥体细胞，在运动皮层内Ⅰ～Ⅵ层均有分布，以Ⅰ～Ⅲ层较多，Ⅵ层最少，免疫反应性细胞以小细胞(41.5%)及中等大小细胞(44%)为主，也可见少量梭形细胞(13.5%)，而大细胞极少(1%)。这些不同形态与大小的细胞也有层次分布的特征：Ⅰ、Ⅵ层以小细胞为主，而Ⅱ～Ⅲ、Ⅴ层则以中等大小细胞为主。电镜下，甘氨酸免疫反应性神经元呈现中间神经元的特征：胞体小、核大浆少、核内陷。胞体上既可见具有扁平或多形囊泡的终末形成的对称型突触(79.7%)，也可见含球形、清亮囊泡的终末形成的非对称型突触(20.3%)。它的树突上也可见这两种突触类型，近端树突上与胞体相似，以对称型突触为主；而远端细小树突(直径＜1μm)上则以非对称型突触为主；呈现树突越细，非对称型突触越多，而对称型突触越少的特征。在运动皮层内未能找到Gly免疫反应性终末分布。结论首次观察到大脑运动皮层内确实存在甘氨酸能神经元，但目前尚不能肯定甘氨酸在皮层内是否具有神经递质的作用，有待进一步研究。

分类号：R322.81文献标识码：A

文章编号：0529-1356(2000)01-1

DISTRIBUTION OF GLYCINE-IMMUNOREACTIVE PROFILES

IN THE RAT MOTOR CORTEX:A LIGHT AND

ELECTRON MICROSCOPIC STUDY

GAO Wen-Jun

(Shanghai Brain Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai200031,China)

ZHENG Ze-hui

(Shanghai Brain Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai200031,China)

Abstract：ObjectiveIt is known that glycine receptor(GlyR) exists extensively in motor cortex,but there is no report on the distribution and characteristics of glycinergic neurons in the cerebral cortex.Here it is the aim.MethodsBy means of immunocytochemical technique at the light and electronic microscopic level,we examined the morphological and ultrastructural characteristics of the glycinergic neurons in rat motor cortex.ResultsThe Gly-ir neurons appeared in all layers,but mainly in layers Ⅰ-Ⅲ,fewer in layer Ⅴ and the least in layer Ⅵ.They were exclusively non-pyramidal shapes and were morphologically heterogeneous with soma size ranging from less than 10μm to greater than 15μm.However,the well-labeled neurons were predominantly small(41.5%) and medium(44%),some spindle-like(13.5%) and few large(1%) cells could also be observed.At the electron microscopic level,the somata of Gly-ir neurons received both of symmetric and asymmetric axosomatic synapses,but the symmetric type accounted for 80% of the total synapses.Likewise,these two types of synapse were also characterized on the Gly-ir dendrites,but the percentage of asymmetric synapses increased progressively with distance from soma.ConclusionsThese data first reported the presence of the Gly-ir neurons in the cerebral cortex.However,it remains unknown whether glycine acts as a neurotransmitter in neocortex, needs further studies.

Key words：Glycine;Immunocytochemistry;Electron microscopy;Motor cortex;Rat▲

甘氨酸(glycine,Gly)是中枢神经系统抑制性神经递质之一，而且是脊髓及部分脑干神经核团内中间神经元的主要抑制性递质，参与感觉传入及运动反射的调控^［1］。然而，关于Gly在皮层内是否作为抑制性神经递质参与锥体神经元的调控至今仍不明了，并有较大的争议^［2～4］。近年来有关Gly的许多生理、生化及受体的研究均表明，Gly可能是皮层内抑制性递质之一^{［2，3，5～7］}，因为将甘氨酸拮抗剂士的宁(strychnine)直接用于大脑皮质可引起惊厥^［8］。而微电泳Gly则可使皮层内约15%～20%的神经元的细胞膜电位超极化、放电频率阻断、EPSP-IPSP的幅度及膜阻抗降低，从而抑制皮层内神经元的活动^［2，5］。Engblom等^［6］证明皮层内Gly与GABA_A受体一样，可介导Cl^-内流而使神经元超极化。但也有研究证明Gly在大脑皮层的作用主要在于调制NMDA受体通道复合体、加强Glu的活性^［4］。自从Gly受体(GlyR)抗体制备成功，人们发现GlyR广泛分布于皮层内锥体神经元胞体及顶树突^［3，7］，而关于Gly-ir神经元在皮层内的分布及其特征却至今未见报道。为此，本实验用免疫组织化学与免疫电镜方法研究Gly免疫阳性神经元在运动皮层内的分布及其形态和超微结构特征。

材料和方法

雄性SD大鼠9只，体重180～250g。动物经戊巴比妥钠腹腔麻醉(42mg/kg)、由心脏灌流生理盐水100ml后，再充以0.1mol/L磷酸缓冲液(PB，pH7.4)配制的4%多聚甲醛和0.5%～2.5%戊二醛溶液，灌流固定40～60min。取脑于4%多聚甲醛溶液中后固定1～2h，0.1mol/L PB(pH7.4)漂洗数次后，振动切片20～30μm,保存于0.1mol/L PB溶液中。免疫组织化学方法步骤如下：含3%正常羊血清(NGS)+0.03%Triton X-100的磷酸缓冲盐溶液(PBS)2h；抗Gly多克隆抗体(1∶500～1 000,Chemicon)孵育液，4℃，48～72h；然后用羊抗兔lgG和兔-PAP复合物(均为1∶200，上海医科大学病理教研室产品)，室温下孵育1～2h；DAB显色。各步骤之间均以0.02mol/L PBS(pH7.4)充分漂洗。光镜切片经裱片、晾干、脱水、中性树指封片、显微镜观察。部分切片在光镜下选片后按电镜常规包埋，步骤简述如下：1%锇酸1h，升度丙酮脱水，Epon 812包埋于60℃,48h聚合。超薄切片，JEM-100CXll电镜观察并摄片。

对照试验：用3%NGS代替一抗做空白对照，染色结果呈阴性。

方法：(1)层次分布：选取3只大鼠运动皮层的5张20μm切片(Fr.1或Fr.3区)，在显微镜(×250)下通过Camera lucida将Gly-ir神经元描绘于白纸上，再从皮层表面至白质在纸上标出宽为500μm的柱状范围，层次的边界通过邻近焦油紫染色切片确定；然后计数每个层次的阳性细胞数，压在右、上线的细胞计数，而左、下线的细胞则不计。(2)细胞大小：在总放大倍数为500倍下，每一层测量50个阳性神经元(Ⅰ层：25个)的长、短径，再根据两者的平均直径和形态对神经元进行分类和计算百分比。(3)电镜观察：将电镜下观察到的阳性标记结构全部摄片并记录。在解剖镜下观察与测量电镜底片上阳性标记结构周围的各种终末形态。以有明显的突触小泡、突触前致密、突触后致密等特征作为突触部位。突触类型和突触所在部位按胞体及树突粗细统计并计算百分比。

结果

1.层次分布

甘氨酸免疫反应性神经元散在地分布于皮层内Ⅰ～Ⅵ层，其中Ⅱ～Ⅲ层相对较多，Ⅰ、Ⅴ层次之，Ⅵ层最低(图1～3)。在每500μm宽度的皮层范围内的平均阳性细胞数为37.3±3.16个。

2.细胞大小与形态

Gly-ir神经元为非锥体形神经元。在大鼠运动皮层内根据Gly-ir细胞的大、中、小以及有一种较明显是梭形的细胞来划分(图2，3；表1)，其中主要为中、小细胞，分别占44.0%和41.5%；大细胞极少见(1%)，梭形细胞相对较多，占13.5%。Ⅱ～Ⅲ、Ⅴ层以中等大小细胞为主(56%)，Ⅰ、Ⅵ层则主要为小细胞(56%)。

图1Camera lucida描绘的Gly-ir神经元的层次分布。在切片20μm厚，500μm宽的柱形方块内，其中Gly-ir神经元的数量较少，见于Ⅰ～Ⅵ层，以Ⅱ～Ⅲ层较多。标尺示200μm

Fig.1Camera lucida drawing of the laminar distribution of the Gly immunoreactive neurons with 500μm width column in 20μm sections.Gly-ir cells sparsely distributed in layers Ⅰ-Ⅵ,among which they were slightly more in layer Ⅱ-Ⅲ.Bar=200μm

图2Nomarski照片显示运动皮层Ⅰ～Ⅲ层Gly-ir神经元的分布。Gly-ir神经元也具有多种形态，且在Ⅱ～Ⅲ层较多，Ⅰ层偶有分布。箭头示Gly-ir神经元标尺示75μm

Fig.2Nomarski photograph showing the Gly-ir neurons in layer Ⅰ-Ⅲ of rat motor cortex.Gly-ir cells were relative more in layer Ⅱ-Ⅲ.Arrows indicating the Gly-ir neurons.Bar=75μm