摘要：目的从成年大鼠纹状体区分离并鉴定神经干细胞。方法利用无血清培养和单细胞克隆技术在成年大鼠纹状体区分离具有单细胞克隆能力的细胞群，选取单个克隆进行连续传代培养获得大量亚克隆，采用免疫荧光细胞化学技术检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。结果从纹状体区分离的细胞群具有连续克隆能力，表达神经上皮干细胞蛋白，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论分离的细胞具有自我更新能力和多分化潜能，表达神经上皮干细胞蛋白，有很强的增殖能力。是中枢神经系统的干细胞。

分类号：Q813文献标识码：A

文章编号：0529-1356(2000)01-17

ISOLATION OF NEURAL STEM CELLS FROM

STRIATUM OF ADULT RATS

LIU Shi-yong

(Department of Neurosurgery,Xinqiao Hospital)

ZHANG Ke-cheng

(Department of Neurosurgery,Xinqiao Hospital)

YANG Hui

(Department of Neurosurgery,Xinqiao Hospital)

CAI Wen-qing

(Department of Histology and Embryology,The Third Military Medical University,Chongqing 400037,China)

HE Jia-quan

(Department of Histology and Embryology,The Third Military Medical University,Chongqing 400037,China)

Abstract：ObjectiveTo isolate neural stem cells from striatum of adult rats.MethodsA cell line which had ability to form clones was isolated from striatum of adult rats by using serum-free cell culture and single cell clone test.A clone was passaged continuously in order to acquire a large number of clones,and immunofluorescence was used to detect Nestin antigen of the clone and specific antigen of mature neural cell after the clone differentiated.ResultsThe cell line isolated from striatum of adult rats expresses Nestin antigen and has the potential to form clones and differentiate into neurons,astrocytes,and oligodendrocytes.ConclusionOur cell line which expresses Nestin antigen is multipotent cell line and has ability to self-renew,and believed that it contains stem cells of the CNS.

Key words：Neural stem cell;Clonal assay;Cell culture;Isolation;Identification;▲

成年哺乳类动物神经系统通常被看作无再生能力的组织，意指神经细胞不能分裂增殖产生新生神经元以替代丢失、缺损的神经元。但近年来的研究对此提出了疑问。首先，人们发现成年个体海马和室管膜下层细胞具有分裂产生新生神经元的能力，尤其是位于室管膜下层的祖细胞增殖后可以沿着一条比较固定的路径迁移到嗅脑并分化为中间神经元^［1～3］。其次，在90年代人们又分离了能不断分裂增殖且具有多种分化潜能的细胞群，并提出了神经干细胞的概念^［4～6］。这种神经干细胞如能被特异性地诱导分化为某种特定神经元以替代丢失的神经元，无疑将为中枢神经系统功能重建和神经再生带来新的希望。本实验首次采用单细胞克隆建立细胞系的方法获取大量亚克隆，在证实其自我更新能力和多分化潜能基础上使用胚胎早期细胞特异性抗原Nestin证明我们所分离的细胞群为神经干细胞，以期为进一步使用和研究神经干细胞奠定基础。

材料和方法

1.动物及主要试剂来源

1.1动物：由第三军医大学动物实验中心提供成年Wistar大鼠(4月大小)。

1.2细胞培养试剂：DMEM/F12和B27(Gibco)、bFGF(Sigma)、胎牛血清(杭州四季青生物材料研究所)。

1.3单克隆抗体及多克隆抗体：抗Nestin IgG(Mckay RDG和Luskin MB惠赠，USA)、5-溴尿嘧啶及其抗体(bromodeoxyuridine,BrdU,Fluka公司提供)、抗NeuN IgG(neuronal nuclei,NeuN,由Dr Mcburney惠赠，USA)、抗GFAP和2，3-环核苷酸磷酸二脂酶IgG(cyclic nucleotide phosphohydrolase,CNP)由Promega公司提供。

1.4其他试剂：SABC-Cy3荧光试剂盒(Sigma,博士德公司代理)、FITC荧光二抗(中山公司)。

2.方法

2.1神经干细胞的分离和传代：取成年大鼠(4月大小)纹状体组织，D-Hank液漂洗，解剖显微镜下剥离脑膜，将上述的脑组织转移到DMEM/F12(1∶1)加B27的无血清培养基，吸管吹打机械分离制作单细胞悬液，台盼蓝染色后细胞计数，于每培养瓶中(75ml培养瓶)加入5×10⁵个细胞，同时加用bFGF(20μg/L)。待原代克隆形成后再次机械分离克隆制作单细胞悬液，每培养瓶中加入5×10⁴个细胞。此后每6～9d机械分离克隆传代1次，方法同前，仍采用无血清培养基加bFGF。在传代的同时进行克隆形成实验，计数每代细胞的克隆形成率。

2.2单细胞克隆及连续传代：采用有限稀释法。选取原代克隆制作的单细胞悬液，细胞计数后稀释到40个细胞/ml，于96孔培养板中滴加稀释的细胞悬液(每孔50μl细胞悬液和50μl无血清培养液，1～2个细胞/孔)，2h后相差显微镜下观察计数，选取仅有1个细胞的培养孔作记号，动态观察。

选取最初只有1个细胞长成的单细胞克隆，机械分离成单细胞悬液，将1个克隆的所有细胞种入25ml培养瓶中培养(培养基仍同前)，待次代克隆长成后连续传代，最后得到大量来自单个细胞的亚克隆，再行免疫荧光和诱导分化实验。

2.3BrdU标记：将BrdU溶于无血清培养基，过滤除菌后种入上述的细胞克隆(BrdU终浓度为5μmol/L)，培养7d待新的克隆形成后转移到培养板中(预先置有多聚赖氨酸涂布盖玻片)，贴壁2h行BrdU抗体免疫荧光染色。

2.4克隆诱导分化：选取部分上述的细胞克隆种植于预先置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的24孔培养板，并加入有血清培养基(5%的胎牛血清+DMEM/F12)，分别于2h后和7d后行免疫荧光检测。

2.5免疫荧光单标和双标实验：将2.4中贴壁2h的细胞克隆行Nestin免疫荧光单标染色。将来自2.2中的克隆(单细胞克隆后代)按2.4的方法培养7d后行NeuN、GFAP和CNP免疫荧光单标染色，来自2.1中的克隆按2.4的方法培养7d后行NeuN和GFAP免疫荧光双标染色，具体方法参照蔡文琴^［7］教授的方法进行。

结果

1.克隆分析

成年大鼠纹状体原代培养细胞在上述的无血清培养基中生长2d后大部分细胞死亡，部分细胞分裂形成2～4个细胞的细胞团，并随时间的推移细胞数目迅速增加，到7d时生长成为数十个细胞到数百个细胞的集落，这些集落均成悬浮球形生长，细胞形态规则，未见到明显的突起生长(图1)。原代克隆的次代培养中发现部分细胞贴壁分化，生长出细长突起，呈散在分布(为分化的祖细胞)，仍出现与原代培养相同的大量次代克隆。在次代克隆的亚克隆培养过程中均出现与次代培养相类似的过程。在原代培养中克隆形成率约为0.5%～1%之间，而次代克隆及随后的亚克隆中克隆形成率则明显升高，波动在10%～20%之间。经传代20代后的细胞仍具有克隆能力(包括单细胞克隆)。为排除细胞的选择性聚集产生细胞集落的可能性，本实验采用单细胞克隆(见下文)。由于上述的克隆均呈悬浮生长，因此非常有利于传代培养。

图1无血清培养液中悬浮的克隆，体外培养第7d。×200

Fig.1A floating clone curtured in serum-free media,7 days in vitro.×200

采用有限稀释法标记仅有1个细胞的培养孔并动态观察，结果显示单个细胞在培养2～3d后分裂为2～4个细胞的小克隆，4～5d出现10～40个细胞的中等大小的克隆，7～10d均发展为上百个细胞的大克隆，细胞形态同前。来自单个细胞的克隆连续传代后获得到大量亚克隆，分裂过程仍同上，呈悬浮球形生长。目前(1999年1月)已连续传代25代(＞6月)。

2.Nestin抗原的表达和BrdU标记

来自成年大鼠纹状体的原代克隆及次代克隆贴壁2h后行Nestin的免疫荧光染色，结果显示克隆呈Nestin抗原阳性(图2)。单细胞克隆后代结果与此相同。在传代20代后的克隆仍显示为Nestin抗原阳性。在克隆培养7d(有血清培养)后行Nestin免疫荧光染色，未见到任何Nestin阳性细胞。BrdU标记结果显示克隆的大部分细胞为BrdU阳性细胞，表明克隆主要由分裂增殖的细胞组成。