摘要：目的研究抗癌药物斑蝥素及去甲斑蝥素诱导人红白血病K562细胞凋亡的细胞学变化特点。方法观察药物作用后K562细胞形态的动态变化、一般及超微结构特征，并用流式细胞术分析斑蝥素及去甲斑蝥素诱导K562细胞凋亡与细胞周期的关系。结果2mg/L斑蝥素及10mg/L去甲斑蝥素作用24h，部分K562细胞质膜突起，染色质异常凝集，原位复染显示这些细胞质膜的通透性没有增强，DNA琼脂糖凝胶电泳呈现细胞凋亡特有的“梯子”状带纹。电镜下，加药处理组中部分细胞染色质凝集成块，没有核膜包被，部分细胞染色质靠核膜边集呈新月形，胞浆浓缩，内质网结构正常或有扩张，呈现典型的凋亡细胞形态。流式细胞术分析结合细胞形态学研究表明，斑蝥素及去甲斑蝥素诱导K562细胞凋亡与细胞G₂/M期阻滞相关。结论斑蝥素及去甲斑蝥素能够诱导K562细胞凋亡，凋亡大部分发生在细胞周期的M期，也有少量发生在间期，是多点启动的。

分类号：R979.1文献标识码：A

文章编号：0529-1356(2000)01-56

STUDIES ON APOPTOTIC CYTOLOGY OF K562 HUMAN

MYELOID LEUKEMIA CELLS INDUCED BY

CANTHARIDIN AND NORCANTHARIDIN

SUN Zhen-xiao

(Liaocheng Teachers University,Shandong 252059,China)

WEI Yu-lin

(China-Japan Friendship Institute of Clinical Medical Sciences, Beijing 100029,China)

ZHAO Tian-de

(China-Japan Friendship Institute of Clinical Medical Sciences, Beijing 100029,China)

LI Jia-shi

(Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Abstract：ObjectiveStudying the apoptotic cytology of K562 cells induced by cantharidin(CA) and norcantharidin(NCTD).MethodsObserving morphological changes and ultrastructural features of treated K562 cells by phase contrast microscope and electron microscope.Relation between apoptosis and cell cycle of treated K562 cells was examined by fluorescence-activated cell sorting (FACS)analysis.ResultsSome K562 cells show cell membrane bubbling and nuclear chromatin compacting after treated with 2mg/L CA or 10mg/L NCTD for 24h.The membrane permeability of treated K562 cells proved no increase by counterstaining in situ.An apoptosis characteristic DNA“Ladder” detected by using agarose gel electrophoresis.Several masses of condensed chromatin without nuclear membrane were observed in some treated K562 cells,while chromatin of some other cells tended to marginate in crescents around the nuclear envelope with compacting cytoplasm,normal or slightly expanded endoplasmic reticulum,which presented typical morphology of apoptosis.FACS analysis of DNA profiles and cell morphological studies indicated that the apoptosis was related to tumor cell G₂/M phase blocking.ConclusionsApoptosis was induced by CA and NCTD in K562 cells,most of which initiated in mitosis phase,others in interphase.

Key words：Cantharidin; Norcantharidin; Apoptosis; K562 cell; Cell cycle▲

斑蝥为常用中药之一，具有攻坚蚀疮、破血散结的功能。斑蝥体内所含斑蝥素(cantharidin,CA)已证明有抗肿瘤活性。临床上，CA能够缓解原发性肝癌患者病情，提高1年生存率。动物实验表明，CA可以刺激骨髓产生白细胞，使外周血中白细胞数升高(升白)。但是CA有剧烈毒性，小鼠急性LD₅₀(ip)为1.0mg/kg。临床应用CA有强烈的泌尿系刺激作用，使患者难以坚持治疗。而且由于CA产生泌尿系刺激剂量低于其升白剂量，临床应用剂量下不能表现其升白作用。去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)由呋喃及顺丁烯二酸酐加成、氢化而得，与CA相比，缺少1，2位的两个甲基，立体构型相同，其毒性显著降低，小鼠急性LD₅₀(ip)为12.5mg/kg。临床应用NCTD治疗多种癌症，以原发性肝癌为主，毒副作用大大降低，升白效果显著^［1，2］。NCTD能够诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡^［3］。我们研究了CA及NCTD诱导K562细胞凋亡的细胞学变化特点。

材料和方法

1. 细胞系及培养条件

人红白血病K562细胞(中日友好临床医学研究所细胞室冻存)接种于含10%小牛血清、10⁵IU/L青霉素及10⁵IU/L链霉素的RPMI-1640培养液中，在37℃、含5%CO₂的培养箱内培养传代。加药均在细胞对数生长期内进行。

2. 药品与试剂

CA用丙酮自南方大斑蝥(Mylabris phalerata Pallas.)的干燥虫体中提取、精制而得^［4，5］。NCTD由呋喃及顺丁烯二酸酐经加成、氢化得到^［6］，(北京第四制药厂王广生教授惠赠)。两药均在RPMI-1640内溶解，抽滤灭菌，-20℃保存。RNase A和Proteinase K(E Merck)按分子克隆操作指南^［7］分别配成10g/L和20g/L，-20℃存放。Nonidet P-40(NP-40)：Fluka产品。

3. 细胞的增殖抑制曲线

参照文献［8］，取对数生长期的细胞用生长培养基配成1×10⁸/L悬液，在50ml培养瓶中接种10ml。加入待试药物100μl置含5%CO₂的37℃培养箱中培养，在培养即刻及培养后1、2、3d从对照组及加药处理组各取样40μl，加0.4% Trypan blue 10μl，混匀，反应5min后，血球计数板计数活细胞，15min内计完，每个样品均设3个平行组，结果取3组的平均值，最后以K562细胞生长抑制率对时间作图。

细胞生长抑制率=

4. 细胞DNA片断的提取及琼脂糖凝胶电泳

参照文献［9］收集DNA片段，在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，恒压33V；紫外透射仪上观察并摄影。

5. 细胞形态学观察

5.1生活细胞的形态学：在日本Olympus IMT-2型倒置显微镜(带保温装置)下对活细胞进行动态观察。

5.2Wright-Giemsa染液染色观察细胞及核的形态：细胞推片或离心涂片，固定后，Wright-Giemsa染液染色，光镜下观察。

5.3超微结构观察：细胞经常规2.5%戊二醛、1%锇酸双固定，逐级浓度酒精脱水，Spury Resin树脂包埋，超薄切片，枸橼酸铅-醋酸双氧铀电子染色，JEM-1200EX透射电镜下观察。

6. 流式细胞测定及细胞周期分析

药物处理后不同时间收集细胞，4℃70%乙醇固定24h以上，100mg/L RNase A 37℃消化30min，100mg/L碘化丙啶(PI)4℃染色30min以上。FACS420流式细胞仪上测定，细胞周期分析用SOBR(Sum of Broadened Rectangles Model)软件，低于G₁期DNA含量的细胞为部分凋亡细胞或凋亡小体。

结果

1. CA及NCTD对K562细胞增殖的抑制作用

从图1可以看出，2mg/L CA及10mg/L NCTD均能强烈抑制K562细胞增殖。

图1CA及NCTD对K562细胞增值的抑制作用

Fig.1The inhibition effects of CA and NCTD on proliferation of K562 cells.

2. DNA琼脂糖凝胶电泳

如图2a,b所示，分别用2mg/L CA及10mg/L NCTD处理K562细胞24h，提取各对照组及加药组细胞的DNA片断电泳，加药组均出现凋亡特有的“梯子”状带纹，而对照组没有发现类似的DNA片断的存在。

图2琼脂糖凝胶电泳显示2mg/L CA(A)及10mg/L NCTD(B)作用

人红白血病K562细胞24h后的“梯子”状带纹

Fig.2DNA“Ladder”of K562 cells treated with 2mg/L CA(A)and 10mg/L NCTD(B) for 24h

3. 细胞的形态学观察

2mg/L CA及6～10mg/L NCTD作用K562细胞8h后，细胞形态发生很大变化，相差显微镜下观察，可见K562细胞先变大变圆，随后胞浆呈现不规则突起，继而大部分细胞拉长成“豆角”样，随后，部分细胞胞膜收缢或以类似出芽方式