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分类号：R979.1文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-29
EFFECT OF OLTIPRAZ AND ANTISENCE GST-π ON
APOPTOSIS OF MALIGNANT TRANSFORMED CELLS
BAI Hua
(Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing100021,China)
HU Guo-gang
(Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing100021,China)
ZHU Ming
(Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing100021,China)
WEI Hui-juan
(Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing100021,China)
TIAN Hai-mei
(Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing100021,China)
LUO Xian-mao
(Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing100021,China)
Abstract：ObjectiveTo Study the effect of oltipraz and anti-sence GST-π on apoptosis of malignant transformed Rat-1 cell MethodsGST-π cDNA inserted retroviral expression vectors pDORneo were constructed into recombinant pDGSTas and transfected to T-Rat-1 cell by Lipofectin;T-Rat-1 cell containing anti-sense GST-π RNA(AT-Rat-1) was obtained by G418 screening; then Rat-1,T-Rat-1 and AT-Rat-1 cells were treated by oltipraz,The apoptosis of above cells was analyzed by DNA agarose gel electrophoresis and flow cytometry examination.ResultsGST-π protein content of AT-Rat-1 is lower than that of T-Rat-1 by ELISA.Oltipraz has a obvious effect of inducing AT-Rat-1 cell apoptosis in 130-140mg/L.Meanwhile,it is shown that c-fos mRNA of AT-Rat-1 cell is higher experssion than that of T-Rat-1 by Northern blot analysis.ConclusionThe apoptosis of AT-Rat-1 cell can be induced by a effective dose of oltipraz; The high expression of c-fos gene and low expression of GST-π gene are related to AT-Tat-1 cell apoptosis.
Key words：oltipraz; apoptosis; GST▲
用致癌素香烟凝聚物(cigarette smoking condensate,CSC)处理人胚肺组织，提取DNA转化大鼠成纤维细胞Rat-1，能获得一种介于良性细胞和癌细胞之间的恶性转化Rat-1细胞(transformed Rat-1,T-Rat-1),该细胞处在癌变的早期阶段［1］。谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)是人肺癌变早期的精确标记之一，GST-π基因的异常表达也许能抑制细胞凋亡的启动，而促进细胞癌变［2］。我们推测反义GST-π能够抑制恶性转化细胞的癌变，故此构建了一个带有反义GST-πRNA的重组质粒，导入恶性转化Rat-1细胞，并进行了深入研究。
另一方面，oltipraz是从十字花科绿色植物中提取的巯基类化合物，全称：5-(2-吡嗪基)-4-甲1、2-二羟基-3-硫酮。1993年美国NCI倡仪用它作临床Ⅰ期抗癌药物试验。oltipraz防癌抑癌的作用，与其影响GSTs、醌还原酶、环氧化脱氢酶、酪氨酸蛋白激酶(TPK)、细胞色素P450、黄曲霉素B1醛还原酶(AFAR)等密切相关［3］。它是否能诱导某些细胞的凋亡是令人感兴趣的问题。我们将oltipraz与反义GST-π、原癌基因之一c-fos联系起来进行研究，试图在细胞增殖、分化、癌变、凋亡之间找出某些规律性。
材料和方法
1.实验材料
Rat-1细胞为大鼠成纤维细胞，具有异倍体核型，但无致瘤性，属非恶性细胞，由中国医学科学院肿瘤所李申德教授惠赠。PA317细胞为病毒包装细胞，由中国医学科学院分子免疫室孙宗棠教授惠赠。NIH3T3细胞为小鼠成纤维细胞，由陈秋燕博士提供。
质粒GST-π为全长人GST-π cDNA克隆在PUC18质粒中，经EcoRI酶切后获得的0.75kb的GST-π cDNA,由日本东京大学Muramatsu教授惠赠。质粒pDORneo长6.55kb，包含了M-MuLV5′和3′-LTR，SV40早期启动子驱动NED基因，含有部分PBR322片段，可在E.coli中复制并有Amp抗性，多克隆位点上有3个单一酶切点，由中国医学科学院细胞生物室转赠。
探针c-fos为1.3kb，购自中山生物公司。β-actin 2.0kb，购自天象人公司。试剂盒：Prime-gene Labeling Kit Promega,转染试剂Lipofectin(GIBC-OBRL),G418均购自东方生物公司；同位素［α-32P］-dCTP，购自福瑞公司；oltipraz由美国NIH Bourat博士赠送。
2.实验方法
2.1“恶性转化Rat-1细胞”的获得，参见文献［4］，反义GST-πRNA(pDGSTas)重组质粒构建参见文献［5］，将pDORneo用EcoRI单酶切后直接用碱性磷酸酶CIAP处理1h，电泳回收后取60ng处理过的线性载体加25ng GST-π cDNA片断，在10μl反应体系中T4DNA连结酶连接3h，取2μl转染E.coli HB101，快提鉴定。GST-π cDNA计算机读码分析，以确定酶切鉴定用的合适酶切位点。
2.2GST活性测定：(1)样品制备：PBS洗细胞，刮下，破碎，4℃离心；(2)样品蛋白含量测定：求标准曲线，取样品100μl加入碱铜-酚试剂，测OD750；(3)GSTs活性：取0.2mol/L磷酸缓冲液2ml，加底物20mmol/L CDNB 500μl；20mmol/L GSH 50μl，样品100μl，测OD340;(4)GST-π测定(ELISA法)：用小鼠单抗MAbⅢ，BSA包被，加样品或抗原标准，加多抗，再加驴抗兔IgG-碱性磷酸酶，加PNPP，最后加3 mol/L NaOH，酶联免疫仪测OD410值；计算各样品GST-π含量(μg/L)，以蛋白含量为基准换算成GST-π实际含量(μg/L protein)。
2.3细胞转染(Lipofectin介导)：(1)病毒颗粒的制备：PA317细胞在1640中培养。将DNA(空载体或重组质粒)10μg,Lipofectin 25μl分别稀释于1.5ml DMEM中，混合后加入单层细胞上混匀，37℃培养12h，36h后1∶4传代并加G418筛选，12d后挑出克隆，24孔板中扩增，取培养上清按1∶10梯度稀释，再感染NIH3T3，G418筛选后计数克隆数。(2)病毒滴度测定：NIH3T3细胞基本满瓶后1∶5传代，分别取病毒液(1∶10，1∶100，1∶1 000)100μl加到单层细胞上，加G418(800mg/L)筛选10d，计数阳性克隆数，病毒滴度为：细胞集落×稀释倍数×10。细胞感染时用高滴度病毒上清。(3)病毒感染靶细胞：选择高滴度的病毒液稀释后加入polybrene,加入Rat-1细胞或恶性Rat-1细胞中，放入CO2孵箱培养，用G418筛选；收集克隆及生长良好的靶细胞为AT-Rat-1；再作其他处理。
2.4Northern Blot:取对数生长期细胞，按不同实验要求在不同时间常规提取RNA，每组样品含细胞约1×107个。用随机引物法进行c-fos基因探针标记，设定β-actin对照；按Promega提供的程序操作。取RNA 20μg在1.2%甲醛变性凝胶上电泳，用毛细管法将变性的RNA转移至硝酸纤维膜，42℃杂交，X光片显影，-70℃曝光。
2.5与细胞凋亡相关的实验：(1)流式细胞分析(PI染色法)：胰酶消化制细胞悬液，乙醇固定。离心后加200μl RNaseA，水浴30min，加800μl PI染色液混匀，避光。用FACScan流式细胞仪测定。记录488nm处红色荧光，以Cell FIT软件分析处理数据。(2)DNA凝胶电泳分析：药物处理后按常规法提取细胞DNA，置于含EBr的琼脂糖凝胶中进行电泳。(3)细胞毒理的比色法测定(SRB法)：用96孔板，每孔加0.1ml DMEM(含细胞5 000／孔)，第2d用不同浓度(50、75、100、125、150、200mg/L)的oltipraz处理细胞，再培养24h，48h或72h。每孔加10%三氯醋酸100μl，清水洗，空气干燥，再每孔加入0.4%SRB100μl，1%醋酸洗，最后加入Tris,用酶联免疫仪检测570nmA值。
