摘要：目的研究FN6-8片段能否促进损伤神经元的突起生长。方法从包含有TN-C分子中FN6-8DNA序列的质粒中表达并纯化GST-FN6-8融合蛋白，以0.05mg/L的浓度加入培养的胚胎小鼠脊髓神经元的培养液中，对照组加入等量GST，然后液体石蜡封闭液面造成神经元缺气损伤，3d后做MTT实验，测神经元活性并图像分析神经元突起的长度。结果FN6-8组的神经元活性和神经元突起长度明显高于对照组。结论TN-C促进神经元活性及突起生长的功能可能由其FN6-8片段介导。

分类号：Q513.2；Q954.52文献标识码：A

文章编号：0529-1356(2000)01-5

THE EFFECT OF FN6-8 FRAGMENT PROTEIN OF TENASCIN-C

ON NEURONS FROM SPINAL CORDS

YANG Da-li

(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an710032,China)

HUANG Wen-jin

(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an710032,China)

LIANG Zhe

(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an710032,China)

YANG Hao

(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an710032,China)

JU Gong

(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an710032,China)

Abstract：ObjectiveTo study the function of FN6-8 of TN-C.MethodsGST-linked FN6-8 fusion protein was expressed from the plasmid containing the DNA sequence of FN6-8 of TN-C.This fusion protein was added into culture medium of neurons from spinal cords of embryonic mice at the final concentration of 0.05mg/L.Equal volume of GST was added into the medium of the control group.Then liquid paraffin wax was added into the medium to create the air-deprived injury neurons.Three dyas later,MTT assay and image analysis were preformed to examine the activity and the neurite length of the neurons.ResultsFN6-8 can significantly promote the activity and neurite length of the gas-deprived neuron of the spinal cord.ConclusionThe ability of FN-C to promote the viability and neurite length could be induced by FN6-8.

Key words：TN-C;FN6-8 fragment;neuronal activity;neurite length▲

Tenascin-C(TN-C)是发现较晚的细胞外基质大分子糖蛋白，功能复杂而强大，参与胚胎多种组织的发育及神经的损伤再生^［1，2］、肿瘤发生、炎症反应等过程^［3］。其分子由类似表皮生长因子、三型纤维粘连蛋白、纤维蛋白元的重复片段组成^［4］。抗体抑制实验证明TN-C分子介导神经元突起生长的位点在其类似三型纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)的第6～8重复片段上，我们用重组的片段蛋白证明了FN6-8能促进培养的脊髓神经元的活性及突起生长^［5］。目前多种促神经突起生长的生物活性分子都应用于神经损伤后再生的研究，FN6-8有关研究尚未见报道。我们利用神经元缺气损伤模型，研究了FN6-8对损伤神经元的影响，发现FN6-8能明显促进缺气损伤神经元的活性及突起生长。

材料和方法

1.FN6-8片段蛋白

FN6-8段蛋白(由本所分子生物实验室提供)。将编码小鼠TN-C分子中FN6-8重复片段的DNA序列(1304bp)融合至大肠杆菌表达载体pGEX-KG表达框架中的谷光甘肽转移酶(glutathione s-transferase,GST)基因3′端以构建质粒(加拿大Mcgill大学肖志成博士赠)，将质粒转化入大肠杆菌JM-109(Promega)，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)诱导表达出与GST融合的FN6-8片段蛋白(分子量为55kD)，用谷胱甘肽琼脂糖(Sigma)从细菌总蛋白中纯化融合蛋白。

2.动物

E12～14d的昆明小白鼠

3.胎鼠脊髓神经元的有血清培养^［6］

用改良的Random法，无菌取胚胎，于解剖显微镜下小心剥离脊髓，剥净血膜，剪碎组织至1mm³，0.125%胰酶(Sigma)消化，37℃,25min,用完全培养液(DMEM 10/10)胎牛血清/马血清，Sigma)终止消化10min，吹打制成5×10⁵/ml的细胞悬液，接种于涂有鼠尾胶(自制)的96孔培养板(0.1ml/孔)和24孔培养板(0.5ml/孔)。24h后各孔以10^-5mol浓度加入阿糖胞苷，48h后各孔换以不完全培养液(含10%马血清的DMEM)。

4.胎鼠脊髓神经元缺气损伤的模型建立

于培养第3d，更换培养液，各孔加入0.05mg/L的FN6-8，对照组加入等浓度的GST，并沿孔壁轻轻加入适量石蜡油使培养液完全与外界隔绝。

5.FN6-8对脊髓神经元活性的影响

96孔板于液体石蜡封闭培养3d后，各孔加入四唑盐(MTT，Sigma)，终浓度15μm，37℃孵育4h后，轻轻吸除上清，各孔加入二甲亚砜(DMSO，上海)100μl,待四唑盐结晶充分溶解后，于Dynatech,MR4000读数仪上(日本)测570nm波长下的A值(参考波长为630nm)^［7］。

6.FN6-8对脊髓神经元突起生长的影响

24孔板于液体石蜡封闭培养3d后，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定1h，尼氏染色。Camera Lucida显微镜下随机选择3个孔，描绘出各孔神经元。于图像分析仪上(Quentmet570)分析各组双突起和多突起神经元的平均突起长度。

7.统计学分析

所得各值作t检验。

结果

1.胚胎小鼠脊髓神经元的培养

种植细胞4h后，部分细胞贴壁，呈圆形，偶见短的突起，12h后，大部分细胞贴壁，2～3个细胞聚集成团，多数细胞长出短突起，24h后，仅见少量漂浮细胞，已贴壁的细胞聚集明显，从细胞团中长出毛刺样的突起，可分辨出胞体暗淡扁平的胶质细胞和胞体透亮、立体感强的神经元，阿糖胞苷作用24h后，胶质细胞停止分裂、增殖，神经元持续生长、突起伸长、培养1周后，神经元细胞团逐渐分散成单个的细胞。

2.FN6-8对缺气损伤的脊髓神经元的活性影响

MTT结果显示，FN6-8+石蜡组的A值明显大于GST+石蜡组(P＜0.05)(图1)。说明FN6-8可提高损伤神经元的活性。

图1FN6-8对培养的脊髓缺气神经元脊髓活性的影响

(*P＜0.05与GST+石蜡组比较n=8)

Fig.1The effect of FN6-8 on the viability of gas

-depriving injuried neurons from spinal cord in vitro

(*P＜0.05 vs GST+paraffin wax n=8)3.FN6-8对缺气损伤的脊髓神经元突起生长的影响

神经元被尼氏染液染成淡蓝色，胞体染色深，突起染色较浅。由于此培养体系中的单极神经元极少，我们用双极和多极神经元的突起长度代表整体神经元突起的长度。图像分析结果显示，FN6-8+石蜡组的双极和三极神经元的突起长度明显大于GST+石蜡组(P＜0.05)(图2)。说明FN6-8可明显促进神经元的突起生长。

图2FN6-8对培养的脊髓缺气损伤神经元突起长度的影响

(*P＜0.05与相应GST+石蜡组比较)

Fig.2The effect of FN6-8 on the neurit length of the gas

-depriving injuried neurons from spinal cord in vitro

(*P＜0.05 vs GST+paraffin wax)

讨论

1.脊髓神经元的缺气损伤模型

用无菌的液体石蜡封闭培养液面，造成培养液与外界隔绝，培养物缺乏氧气供应和充足的CO₂以调节培养液的酸硷平衡，使培养物在多种不利因素的影响下，生长缓慢、部分细胞突起退化，胞体变圆，折光性减弱，随着缺气的持续，将导致神经元由最初的突起生长缓慢，到最后神经元损伤甚至死亡。此法原用于神经电生理实验，我们将此模型造成培养细胞缺气损伤^［8］。

2.FN6-8促进脊髓缺气损伤神经元的活性和突起生长