设为首页
加入收藏
求医中医药网
www.qe.cn
站内搜索
分类号：R739.7+ 2文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-61
THE EFFECT OF 8-Br-cAMP ON EXPRESSION OF
ANTIONCOGENES IN HUMAN RETINOBLASTOMA
HXO-Rb44 CELLS IN VITRO
DENG Xin-guo
(Henan Institute of Ophthalmology,Zhengzhou 450003,China)
GUO Xue
(Henan Institute of Ophthalmology,Zhengzhou 450003,China)
WU Jing-lan
(Henan Health and Proventive Station,Zhengzhou 450003,China)
GUO Xi-rang
(Henan Institute of Ophthalmology,Zhengzhou 450003,China)
PANG Guang-ren
(Henan Institute of Ophthalmology,Zhengzhou 450003,China)
TIAN Xiao-li
(Henan Institute of Ophthalmology,Zhengzhou 450003,China)
Abstract：ObjectiveTo study 8-Br-cAMP effect on cell growth and antioncogene expression in human retinoblastoma HXO-Rb44 cells.MethodsThe p16INK4mRNA,p21WAF1 mRNA,w(wild type)p53 mRNA,m(mutant type)p53 mRNA and Rb mRNA were detected by in situ hybridization and RNA dot blot technique.The PCNA,p16,p21WAF1,pRb,cdk2 and cdk4 proteins were detected by immunohistochemistry and protein dot blot technique.ResultsThe signals of p21WAF1 mRNA,p16INK4mRNA,wp53 mRNA,mp53 mRNA and Rb mRNA were localized in the cytoplasm of HXO-Rb44 cells.The p16-IR,p21WAF1-IR and pRb-IR were predominently localized in the nuclei.In the dot blot the relative scanning value of p16INK4 mRNA,p21waf1 mRNA,wp53 mRNA,Rb mRNA and p16-IR,p21WAF1-IR,pRb-IR of the exprimental groups(EG,treated with 8-Br-cAMP)was higher than that in respective control groups(CG,treated with no 8-Br-cAMP),P＜0.05-0.01.However,the scanning value of the mp53 mRNA,PCNA-IR,cdk2-IR and cdk4-IR of EG was lower than that in respective control groups,P＜0.05-0.01.Conclusions(1)8-Br-cAMP could inhibit human HXO-Rb44 cell growth and proliferation.(2)8-Br-cAMP could up-regulate antioncogene expression,including mRNA expression of p16INK4,p21waf1,wp53 and Rb and protein expression of p16,p21WAFl and pRb.(3)8-Br-cAMP could down-regulate expression of mp53 mRNA,PCNA-IR,cdk2-IR and cdk4-IR expression.(4)The results suggest that 8-Br-cAMP may decrease human HXO-Rb44 cell growth via inhibition of cell cycle progressing related gene expression.
Key words：Retinoblastoma cell; Antioncogene; In situ hybridization; CDKs▲
近年研究表明，cAMP受体可分为RⅠ及RⅡ两型，此两型通过基因调控，一般在细胞中呈正负调节因子调控细胞的生长和分化。RⅠ型促进细胞生长，抑制细胞成熟及分化，而RⅡ型则抑制细胞生长而促进细胞早期分化。关于cAMPRⅡα亚型(α亚型不具组织特异性)的选择性结合位点类似物主要有8-Cl-cAMP和8-Br-cAMP，两者效应相似［1］，前者作用更强，后者无毒性，国外多应用8-Br-cAMP于研究工作。人视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞为缺失Rb基因的细胞系，恶性肿瘤的发生主要由于一方面原癌基因激活为癌基因，另一方面则可由于抑癌基因的失活。我们研究8-Br-cAMP对人视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)HXO-Rb44细胞的有关抑癌基因表达的效应而探讨其对细胞生长的关系，至今未见有关这方面的报道。
材料和方法
1. HXO-Rb44细胞标本的制备
将体外培养的人HXO-Rb44细胞系(湖南医科大学赠)等分为两组，1组加终浓度为2×10-5mol/L 8-Br-cAMP(Sigma)的实验组(EG)，另1组为不加8-Br-cAMP的对照组(CG)。培养24h后，最后调整细胞浓度为1×107个/ml，分别将两组的细胞悬液滴于硝酸纤维素膜(NCM)和玻片上制备两种标本。
2. NCM完整细胞mRNA斑点印迹
参照“实用非放射性分子生物学实验技术”［2］介绍的方法，主要步骤依次为：滴膜标本经氯仿蒸气裂解细胞膜暴露细胞质内的RNA，用RNA变性液在NCM下渗透变性，真空烤膜，打孔取样放入96孔板(COSTAR)内(EG和CG各9～10个样本)，预杂交后，分别加各种生物素标记的cDNA探针，包括p16INK4、p21waf1、野生型(w)p53、突变型(m)p53和Rb的cDNA探针(各探针的灵敏度达1.0～0.1pg)，进行杂交，0.1×SSC、4×15min严格洗涤，乙酰化牛血清白蛋白(acetylated BSA)封闭后，加链霉亲和素碱性磷酸酶复合物(Promega)孵育，洗涤，以四唑盐(NBT)与5-溴4-氯3-吲哚磷酸(BCIP)为底物进行显色。以不加探针杂交液和以RNase(Promega)100mg/L预消化作为阴性对照。
3. 玻片原位杂交
参照“实用非放射性分子生物学实验技术”［2］的方法，主要步骤依次为：Bouin液固定10min，5mg/L蛋白酶K(Sigma)37℃消化、10min,4%多聚甲醛后固定，乙酸酐/三乙醇胺处理，洗涤，晾干，其余步骤及所检测的mRNA和阴性对照同2。
4. NCM完整细胞蛋白质斑点印迹
应用间接酶标抗体的免疫组织化学方法，主要步骤为：点膜标本经氯仿蒸气裂解细胞膜暴露细胞质内的蛋白质，加0.5%吐温-20/TBS(Tris-HCl Buffer,pH7.2)封闭，加各自的第一抗血清，其中包括PCNA、p16、p21WAF1、Rb、cdk2、cdk4、(Santa、DAKO或Zymed)。0.01%吐温-20/BTS洗两次，加碱性磷酸酶标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG(Santa)，加NBT/BCIP底物液进行免疫组织化学显色，以不加一抗或不加二抗作为阴性对照。
5. 玻片免疫组织化学
应用常规间接酶标免疫组织化学方法检测，由于标本经过多聚甲醛固定，首先以微波炉复性组织抗原(0.01mol/L枸橼酸缓冲液pH6.0、98℃、2min)，再进行免疫组织化学反应，其余步骤及所检测的抗原和阴性对照同完整细胞蛋白质斑点印迹。
6. 结果判定
用岛津薄层层析扫描仪(波长为530nm)对基因表达的mRNA和基因表达的蛋白质产物斑点印迹信号进行扫描测定。在油镜下观察原位杂交信号及免疫组织化学反应性的定位。
结果
1. HXO-Rb44细胞内p16INK4、p21waf1、wp53、mp53、Rb的mRNA及其蛋白质表达产物的定位
应用碱性磷酸酶显色体系全部杂交信号及免疫反应性(IR)均呈紫色细颗粒。mRNA的信号均位于细胞质，p16-IR、p21WAF1-IR及Rb-IR位于胞核及胞质，以胞核为主(图1～8)。
