【摘要】目的利用原位杂交检测味细胞中G蛋白的表达。 方法分别用RT-PCR方法克隆大鼠味蛋白及(α-rod)转导蛋白的全长cDNA，制 备地高 辛标记的正义链及反义链探针。结果原位杂交分析了150个大鼠味蕾 ， 结果显示味蛋白和转导蛋白在舌味蕾细胞中都有表达。但两种蛋白标记细胞数量有明显差别 。每个味蕾大约有1.2个转导蛋白阳性细胞，占总味蕾细胞的0.8%；而每个味蕾平均有6. 2个味蛋白阳性细胞，占总味蕾细胞的4.1%；即味蕾中味蛋白阳性细胞大约是转导蛋白阳性 细 胞的5倍。转导蛋白探针对味蛋白mRNA无交叉杂交反应。在视网膜上可见转导蛋白基因的高 度 表达，而无味蛋白的表达。结论味蛋白和转导蛋白可能是味细胞的G -蛋白，但以味蛋白特异性表达为主，它们可能参与味觉的信号转导作用。

【中图分类号】Q189【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)-增-41

IN SITU HYBRIDIZATION DETECTION OF GUSTDUCIN AND TRANSDUCIN EXPRESSION IN TASTE BUDS

YANG Hui，XU Qun-Yuan

(Beijing Institute for Neuroscience，Capital University of Medical S ciences，Beijing 100054， China；)

ROPER Stephen，CHAUDHARI Niru pa

(University of Miami School of Medicine，Miami FL33101，USA)

【Abstract】ObjectiveThe in situ hybridiza tio n method was used with signal amplification system for detecting G-protein expr ession in taste buds.Methods The gene of gustducin and α-ro d tr ansducin in rat are cloned by RT-PCR.Their sense and antisense probes were labe l ed with digoxigenin.About 150 taste buds in rat vallate and foliate papillae wer e analyzed.Results The results showed that there were 1.2 tra n sducin-positive cells and 6.2 gustducin-positive cells counted in each taste b ud profile on average.The number of gustduin-positive cells was approximately fiv e times more than transducin-positive cells in taste buds.There were 4.1% gustd u cin-positive cells and 0.8% transducin-positive cells in all taste cells.It c ou ld not be seen any cross reation of transducin probe to gustducin target.The hi gh expression of transducin in retina was also observed but no gustducin express ion could be detected.Conclusion The result of present study p roved that both transducin and gustducin were taste G-protein and gustducin was high expressed.Both of them might be involved in taste signal transduction.

【Key words】Gustducin;Transducin;in situ hyb ridization;Taste

一般认为，哺乳动物能感受5种基本味质，即甜、苦、酸、咸、鲜^{［1 ］}。生理学研究 表明，不同味感受器对不同的味质选择性地产生反应^［2，3］但反应模式不甚相同， 其中，酸和咸味质通过味感受器细胞膜上特异性的H⁺和Na⁺离子通道使细胞去极化；甜 、苦和鲜味质则通过GTP-结合蛋白和具有7个跨膜区的受体进行信号转导^［4，5］。 已知味蛋白(gustducin)是一种味觉特异性G-蛋白^［6］，专门表达于舌味蕾细胞而 不 表达于其他细胞。已有研究证明，味蛋白与主要参与视觉信号转导的转导蛋白(transducin) 有很高的同源性^［7］，是两种相似的G-蛋白。因此，我们认为它们应该都能够选择 性地表达于味蕾细胞上，并可能是苦味、甜味和鲜味信号转导反应的重要成分^［8］ 。

为进一步证实这一设想，我们利用高敏感度的原位杂交手段来检测味蛋白和转导蛋白在大鼠 舌味蕾的分布，希望能显示味细胞在表达上述两种G-蛋白数量上的差别，以便深入探讨它 们在味觉感受机制中的作用。

材料和方法

1.cDNA 克隆和RNA探针

选用大鼠舌的轮廓乳头和叶状乳头组织以及大鼠视网膜组织，提纯这些组织的mRNA(采用Inv itrogen公司的Fast Track药盒)，通过逆转录酶(GIBCO BRL 公司)合成cDNA。其中，根据大 鼠味蛋白序列83-232位氨基酸设计上游和下游PCR引物^［6］，进行RT-PCR。将PC R产生的1.37kb的基因片段克隆进入PKS载体(Stratagene公司)。另外，按照小鼠α-rod转 导蛋白序列6-347位氨基酸设计PCR引物^［7］，再克隆1.03kb的基因片段进入PKS载 体。将上述两种基因克隆进行DNA序列分析。

上述两种基因的载体，经过线性化处理，在T₇RNA聚合酶催化下，转录合成地高辛标记的 正 义链和反义链RNA探针(Roche公司的核酸标记检测试剂盒)。利用梯度倍比稀释法，将不同浓 度的待测探针及标准探针点到尼龙膜上，利用地高辛抗体-碱性磷酸酶(digoxigenin-alka li ne phosphatase，DIG-AP)系统呈色。比较待测与标准的色度，确定探针浓度，最后稀释成 10mg/L，分装、贮存于-80℃备用。此探针可用来进行原位杂交和Northern印迹杂交。

2.原位杂交

2.1组织预处理：取大鼠上述组织以OCT包埋，快速液氮冷冻，在冰冻切片机上切取10 μm厚 的切片。以40g/L的多聚甲醛固定，室温下20min，磷酸盐缓冲液冲洗；加入10ml/L过氧化氢 20min以除去内源性过氧化物酶；以0.2mol/L HCI室温处理8min，除去内源性的碱性磷酸酶 ；以10mg/L的蛋白酶K室温消化10min，使组织穿透性增加；使用0.1mol/L三乙醇胺/无水乙 酸酐孵育10min，除去非特异性背景；最后用2×SSC冲洗。

2.2杂交反应及后处理：将探针稀释于杂交液中50mg/L，80℃加热5min，将探针加到载 玻片 上，每块组织50μl(根据组织大小)，将组织以盖玻片封好，放入湿盒杂交过夜约50～60℃( 根据探针的Tm值确定)。杂交后第2d以一定严格度进行洗脱。(一般用500ml/L甲酰胺)。1×S SC在50℃洗脱20min，2次。0.2×SSC在50℃洗脱20min。

2.3免疫检测：以洗脱液冲洗5min，加入10g/L阻断液(NEN公司的ISH信号放大药盒)在3 7℃ 下封闭30min，在抗地高辛辣根过氧化物酶(digoxigenin-Horseradish peroxidase，DIG- H RP，1：50)中室温孵育1h后洗脱；重新加入阻断液和生物素-酪胺(biotin-tyramide)，置 于 暗处室温下10min后，洗脱液冲洗3次，每次5min；转入链球菌卵白素-碱性磷酸酶(strepta vidin-alkaline phosphatase，SP-AP)中室温下孵育1h后，洗脱液冲洗同上；再置于检测 液 内10min，在载玻片的组织上，加碱性磷酸酶反应底物(NBT，BCIP)，然后置于暗处湿盒中呈 色 。根据情况大约需10min至6h，加入TE缓冲液终止反应；使用Gelmount试剂(Fisher公司)封 片，观察结果。详细方法及试剂见文献^［9，10］。

3.Northern印迹杂交

体外转录合成味蛋白和转导蛋白基因的正义链，进行RNA琼酯糖凝胶电泳，转印到尼龙膜上 ，利用地高辛标记的转导蛋白基因的反义RNA链为探针，进行杂交。通过抗地高辛抗体与碱 性磷酸酶催化的化学发光反应在X线胶片上成像。

结果

1.味蛋白及转导蛋白基因克隆

利用RT-PCR方法分别克隆得到1.37kb的大鼠α-味蛋白基因(包括全部编码序列)和1.03k b的大鼠α-rod转导蛋白基因。通过测序确定克隆的大鼠味蛋白基因与已知序列相同^{［ 6 ］}，大鼠转导蛋白基因与小鼠的已知序列达99%相同^［7］。分析表明，克隆的大鼠 味蛋白基因与转导蛋白基因有71%的同源性。

2.Northern印迹杂交

由于味蛋白与转导蛋白有71%的同源性，为避免交叉反应，利用体外转录合成味蛋白和转导 蛋白正义链RNA，以DIG标记1.03kb长的转导蛋白反义链RNA为探针，在高严格度的条件下， 进行Northern印迹杂交，结果如图1所示。在电泳凝胶(图1a)上，可见转导蛋白(T)与味蛋白 (G)的RNA量基本相同。杂交后可见明显的转导蛋白RNA阳性杂交带，而没有味蛋白RNA与转导 蛋白探针的杂交带(图1b)。这证明在高严格度条件下有很高同源性的转导蛋白与味蛋白不产 生交叉杂交反应。因此，这种高严格度条件可用来进行原位杂交。

3.原位杂交

我们利用DIG标记1.37kb的α-味蛋白反义RNA链及1.03kb的α-rod转导蛋白反义RNA链 为试验探针，它们的正义链RNA为对照探针，进行大鼠视网膜及舌味蕾组织的原位杂交。为 提高原位杂交的敏感性，利用生物素-酪胺法使原位杂交信号放大。视网膜原位杂交结果如 图2显示，在视网膜的内节层和外核层即感光细胞所在部位有明显的α-rod转导蛋白的表达 (图2a)，但无论在视网膜的任何细胞均未见α-味蛋白的表达(图2b)。

大鼠舌味蕾的原位杂交如图3显示，转导蛋白 mRNA在舌味蕾细胞中有一些表达(图3a)，而转 导蛋白mRNA的正义探针(阴性对照)无杂交反应(图3b)，但味蛋白mRNA在味蕾细胞中有很高的 表达(图3c，d)。本实验在成年大鼠轮廓乳头及叶状乳头的10μm冰冻切片上，共分析了150 个味蕾，平均每个味蕾有1.2个转导蛋白标记的阳性细胞，有6.2个味蛋白标记阳性细胞， 即在味蕾细胞中味蛋白表达的阳性细胞大约是转导蛋白表达阳性细胞的5倍。使用生物素- 酪 胺<