【摘要】目的了解反义 c-myc 基因在平滑肌 细胞中持续、稳定表达对 细胞表型转换的影响。方法分别载有c-myc 第1、2 和3外显子反义片段的3种重组逆转录 病毒表达载体 aM1、aM2 和 aM3 被导入体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞(SMC)，并于持续 筛选后1个月进行稳定表达检测。结果aM2的导入和稳定表达使SMC α -SM actin 的表达 提高了42％，而aM1和aM3 转染后的SMC α-SM actin 表达明显下降。另外，在转染了aM2 的SMC的超微结构中普遍出现明显的肌丝束，而aM1和aM3组则呈现明显的细胞退行性变。 结论反义 c-myc aM2 载体的稳 定表达在体外使 SMC 出现了收缩表型的逆转或部分逆转，而 aM1 和 aM3 则无此功能。

【中图分类号】R541.4【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)增-85

EFFECTS OF THREE KINDS OF ANTISENSE c-mys RNA ON THE PHENOTYPIC

CHANGE OF VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS in vitro

ZENG Rong^*, LI Jin, DAI Yun, LlU Xiao-Rong,AN Jing

(Department of Histology and Embryology, the First Military Medical Uni versity, Guangzhou 510515, China)

【Abstract】Objective In order to investigate effects o f continued and stable expres sive antisense c-myc on vascular smooth muscle cell (VSMC)'s pheno typic variabil ity. Methods Three recombinant retroviral expressive vecto rs, aMl, aM2 and aM3, which respectively loading reverse fragment of exon 1,2 and 3, were transferred in to rat arterious SMC and assayed 1 month after their stable expression. Results aM2 enhanced 42％ SMC α-SM actin expression, while the expressions of aM1 and aM 3 groups were significantly reduced. In addition, SMC transfected with aM2 commo nly appeared bunches of myofilament in ultramicroscopy, while aM1 and aM3 emerge d significant cellular degeneration. Conclusion Stable expr ession of antisense c-myc aM2 vector could transform SM C completely or partly into contractile phenoty pe in vitro, while aM1 and aM3 had no such a function.

【Key word】Antisense; Phenotypic change; Vascular sm ooth muscle cell许多研究已表明在人动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)和再狭窄病变中有异种的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, vSMC)，其中包括合成型^［1］。那么，采用一些抑制SMC 增殖的因素，如反义 c-myc，能否同时起到逆转 SMC 合成表型的作用呢?为此，我们通过流式细胞仪和透射电镜观察了3种反义 c-myc 基因导入对 SMC 表型转换的影响。材料和方法

1.材料

1.1动物：160～180g 雄性SD大鼠，由本校动物所提供。

1.2主要试剂：α-SM actin 单抗(Dako 公司)；小鼠 c-myc (C-33) 单抗(Santa Cruz)；FITC 标记羊抗鼠 IgG(Jackson ImmunoResearch Lab, Inc); DAB (中山公司)。LipofectAMINE (Gibco BRL)；G418、RNaseA、PI(Sigma)；neo 基因引物：P1 5'TCC ATC ATG GCT GCA ATG CGGC 3'; P2 5' GAT AGA AGG CGA TAC GCT GCG AAT CG 3'(北京赛百盛合成)。

1.3主要仪器：CO₂孵箱(Heraeus); 透射电镜(JEM1200-EX 型，Olympus)；流式细胞仪(FACS Calibur, Becton Dickinson)。

2.方法

1.13种反义 c-myc 逆转录病毒表达载体的构建；通过两次亚克隆，将人c-myc 基因组的第1、2和3外显子片段，分别反向连入逆转录病毒载体 pLNCX，构建成载体 aM1、aM2 和 aM3^［4，5］。

1.2大鼠主动脉 SMC 的培养和基因转染：组织块种植法^［6］培养 SMC，并参照 Lipofect AMINE 说明书进行 SMC 稳定转染。

1.3基因组 DNA 的提取和 neo 基因聚合酶链反应检测：按分子克隆常规方法进行。

1.4流式细胞仪测定：将1×10⁶的细胞用胰酶消化，PBS 冲洗1遍，81％乙醇固定，-20℃，30min。PBA (PBS+0.1％NaN₃+0.1％BSA)洗涤2次，用一抗标记(c-myc 1:20稀释，FITC 标记羊抗鼠α-SM actin 为工作液)，4℃过夜(同时设立不加一抗的阴性对照组)。PBA 洗2遍，加入1:100稀释的 FITC 标记羊抗鼠 IgG，4℃，30min。PBA 洗2遍，加入50μl 5mg/L的RNase A,37℃，30min。PBA 洗1次，1ml 50mg/L 的PI染色 30min，过滤后上 FACS Calibur 流式细胞仪，每个样本检测 1～2万个细胞。1.5SMC 透射电镜制片观察：倾去培养液，2.5％戊二醛固定1h，缓冲液充分洗涤，刮下细胞，1％锇酸后固定1h，常规逐级酒精脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，枸橼酸铅和醋酸铀双重染色，透射电镜下观察。

结果

1. 外源基因在 SMC 中的稳定整合。

在G418筛选的第 4d，SMC 开始死亡，第8d未转基因组全部死亡，各转基因组则有数目不等的细胞存活，并在第10d 基本形在克隆。将克隆混合扩大培养，提取基因组 DNA 行 neo 基因 PCR扩增，在4组转基因细胞中均可见到如图1的430bp条带，证实外源基因已在 SMC 染色体基因组中稳定整合。

图1neo 基因 PCR 扩增

Fig.1PCR amplification of neo gene

M.PCR markers(1 000,750,500,300,150,50bp)

1.SMC/pLNCX2.SMC/aM13.SMC/aM24.SMC/aM35.SMC

图2对SMC Myc 表达的影响

Fig.2Stable expression effects on SMC Myc

2.对SMC Myc 蛋白表达的影响(图2)

由上图可知，aM1 的稳定表达明显抑制 c-Myc 的表达，靶蛋白表达量仅为对照的 59.7％，aM2 的稳定表达使细胞 c-Myc 表达量降为对照的 81.3％，而 aM3 的稳定表达则反而使 c-Myc 表达增高5.9％。

3.对SMC α-SM actin 表达的影响(图3)

由上述实验结果可知，aM2载体的导入和稳定表达使SMC α-SM actin的表达提高了42%，而aM1和aM3转染后的SMC α-SM actin的表达明显下降。

图3对SMC α-SM actin表达的影响

Fig.3Effects on SMC α-SM actin

4.对SMC超微结构的影响

在第18代的SMC中，虽然还有密体、密斑的存在，但细胞中已难看到明显的成束出现的肌丝(图4)。转染了空载体的SMC也与其类似，除了部分细胞中线粒体增多外，无明显改变(图5)。转染了aM2的SMC则普遍见到明显的肌丝束，有的甚至绕核环形分布(图6)，除此之外，还可见到粗面内质网变得发达，高尔基体也常见(图7)。而aM1和aM3组则见不到肌丝束和明显的密体、密斑，且呈现明显的细胞退行性变(图8)。

讨论

VSMC是高度分化的细胞，但因其作用非常宽广(包括维持血管的紧张度，修复和重塑血管壁等)，为了完成这些功能，VSMC不得不调节其表型^［1］。VSMC最基本的功能是收缩，即收缩表型，另一方面，它又能够调节为合成型，使合成和增殖能力大大增强，尤其在某些病理条件下会出现表型改变和反分化(dedifferentiation)，导致AS的发展^［1，7］。

VSMC发生表型转换的分子机制尚不明了，但近年来发现其病变过程发生了癌基因有限制的表达增高和异常，其发生与肿瘤的发生有近似之处，是一种良性肿瘤。有实验显示：斑块VSMC在c-myc表达增高2～6倍的同时，α-SM actin(一种SMC特异性表达蛋白，斑块VSMC表型改变的同时伴随有α-SM actin的减少^{［1，8，9］})表达下降^［10］，而且人为地给VSMC转染全长c-myc逆转录病毒表达载体后，其α-SM actin mRNA水平也明显下降^［11］，揭示了c-myc在α-SM actin 表达及SMC表型转换中的重要作用。

人c-myc由3个外显子和两个内含子组成，是一种转录因子。一般认为其第1外显子是转录控制区，第2外显子是转录活性区，第3外显子是编码功能区。Shi Y^［12］等也曾使用c-myc第2外显子起始部的反义寡核苷酸(asONDs)明显抑制猪VSMC体外生长速率，并使I型胶原合成量减少了90%以上，提示SMC在生长抑制的同时合成功能也明显下降，可能发生了表型转换。但使用asONDs具有抑制作用不够持久和稳定、特异性差、细胞摄取率低等问题，同时基于上述c-myc的复杂结构，我们对c-myc的3个外显子分别进行了反义载体的构建，并观察3种反义c-myc基因导入对SMC表型转换的影响。

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