【摘要】目的获得人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，用于治疗 神经系统 疾病；克隆添加Kozak序列的bFGF cDNA序列，用于真核细胞表达。方法 提取国人脑胶质瘤细 胞系BT325总RNA，RT-PCR法扩增bFGF cDNA片段，重组于pGEM-3zf(+)载体，测序正确后构 建 表达载体，转染猴肾成纤维细胞系COS-7，Western Blot 检测表达，收集培养上清用PC-1 2进行活性检测。结果RT-PCR扩增到473bp的带有Kozak序列的cDNA片 段；成功构建了真核表达 载体；在COS-7得到了表达，并有一定的生物活性。结论由克隆到的b FGF cDNA片段构建的真核表达载体能在COS-7中表达、分泌，并具有生物活性。

【中图分类号】Q189［文献标识码］A ［文章编号］0529-1356(2000)-增-76

THE EXPRESSION AND ACTIVITY OF NEWLY-CLONED HUMAN BASLC FIBROBLAST GROWTH FACTOR GENE IN COS-7 CELL

YU Feng-shan, DUAN De-yi, JIANG Chuan-tao, CHEN li-nan, QIN Li-hua , XU Qun-Yuan

(Beijing Institute for Neuroscience, Capital University of Medical Scie nces, Beijing 100054,China)

【Abstract】 ObjectiveThe cDNA fragment of human basic fibr oblast growth factor (bFGF) with additional Kozak sequence was cloned and was th en expressed in eukaryotic cells in order to investigate the roles of bFGF in tr eatment of diseases in the nervous system. Methods T otal cellular RNA of glioma BT325 was isolated and RT-PCR amplification of the c DNA fragments was performed. The fragment was cloned into pGEM-3zf(+) vector an d sequenced. The eukaryotic expression vector was recombined and transfected into fibroblast cell line COS-7. bFGF expression was analysized using Western blot. The effect of bFGF on cultured PC-12 was observed. Results The DNA fragment of 473bp with additional Kozak sequence was amplified from reverse transcription mixture. Eukaryotic expression vector pCI-bFGF was r e combined and expressed in COS-7. The biological activity was shown on the cultu red PC-12 cell.Conclusion Full-length of cDNA of hu man bFGF with additional Kozak sequence was cloned and expressed in COS-7. This expressed product showed biological activity on certain cultured cell.

【Key words】Basic fibroblast growrh factor(bFGF); RT -PCR; cDNA cloning; Western blot各种体内外实验均证实，某些神经营养因子能够促进神经元的存活，抑制凋亡，既能保护神经元免受疾病损伤，又能在进行细胞移植治疗时提高移植细胞的存活率，故在神经系统疾病(如帕金森病、老年性痴呆等)的治疗中有重要的应用前景^［1，2］。

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是一种具有广泛生物学作用的生长因子，对多种来源于中胚层和外胚层的细胞具有促进生长、促进有丝分裂的作用。实验证实，bFGF 是一种重要的神经营养因子，有促进多种神经元的存活和抑制凋亡的作用^［3］；对中脑多巴胺能神经元还有促进轴突生长、提高酪氨酸羟化酶活性、促进对多巴胺的摄取和提高其对抗神经毒性的作用^［4，5］。另外，也有实验证明，bFGF在黑质-纹状体系统中的作用至少部分是由星形胶质细胞介导的^［5］。因此，bFGF基因在当前帕金森病基因治疗研究中应具有重要的价值。

当前国内使用的bFGF基因尤其是人的bFGF基因多来自国外，应用受到诸多限制。为此，本实验拟克隆中国人bFGF cDNA，并构建其真核表达载体，以进一步研究该营养因子在中枢神经系统神经元变性修复中的作用。

材料和方法

1.材料

1.1细胞：人胶质母细胞瘤细胞系BT325，购自北京天坛医院细胞生物室；猴肾成纤维细胞系COS-7，本室冻存；大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12，本室冻存。

1.2PCR 引物：参考GenBank登录的bFGF cDNA 序列(J04513)进行设计，由上海生物工程有限公司合成。其序列如下：

上游引物序列为：5'-GAATTCCACCATGGCAGCCGGGAGCATCA-3'，上游引物从起始密码子ATG开始。

下游引物序列为：5'-TCTAGATCAGCTCTTAGCAGACATTGG-3'，终止于终止密码子TGA，即该序列中的TCA。

分别在上游引物5'端、下游引物3'端引入EcoR I和Xba I 的酶切位点(下画线碱基)，框内所示CCACC为Kozak序列，预期扩增产物长度为485bp。

1.3主要试剂及工具酶：异硫氰酸胍(Gibco),Superscript ll 逆转录酶(Gibco)，pfu DNA 聚合酶(Promega)，dNTPs(Promega),T4多核苷酸激酶(Promega),T4 DNA 连接酶(Promega),pCI-neo(Promega)，核酸内切酶EcoR I、 Xba I、 Sma I、 BamH I和Hinc II (华美)，DMEM(Gibco)，FBS(Gibco),兔抗bFGF 多抗(Santz Cruz)，生物素化山羊抗兔IgG(ZYMED)，预染蛋白分子量标准(Gibco),DAB(Sigma)，其他为国产或进口分析纯试剂。

1.4PCR 反应体系及扩增条件：取逆转录产物，加入上游及下游引物(10pmol/L)用pfu DNA 聚合酶扩增bFGF cDNA。扩增条件：94℃4min; 94℃ 45s, 60℃1min, 72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

2.bFGF cDNA 的克隆

收集培养的BT325细胞约10⁷个，用异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提一步法提取其总RNA^［6］。甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA没有明显降解后，Superscript II 逆转录酶作用下进行逆转录反应。取逆转录产物用上述条件进行 PCR 扩增。取pGEM-3zf(+)质粒，Sma I 单酶切，电泳分离纯化回收酶切产物，制备平端连接载体。PCR扩增产物经电泳回收纯化目的片段，用T4多核苷酸激酶磷酸化其两平齐末端后，与pGEM-3zf(+)栽体于16℃连接20h，转化E.coli JM109，挑取白色菌落筛选重组质粒。重组质粒经筛选鉴定后送北京六合通技术发展有限公司进行序列测定。

3.bFGF 真核表达载休的构建

分别小量提取质粒pGEM-bFGF、pCI-neo，用限制性内切酶 EcoR I、 Xba I 双酶切，电泳分离，玻璃奶纯化回收 bFGF 片段和线性质粒 pCI-neo，T4 DNA 连接酶连接两片段，连接产物转化大肠杆菌 JM109，随机挑取4个菌落，小量提取质粒，用限制性内切酶 EcoR I、 Xba I 作酶切鉴定。

4.bFGF在COS-7细胞中的表达

4.1电穿孔转染：复苏猴肾成纤维细胞系COS-7，培养于含10％FBS的DMEM培养液中。当细胞数目达10⁶个时，收集细胞，加入400μl电转液(hypoosmolar electroporation buffer)重悬细胞。加入5μg质粒pCI-neo-bFGF，混匀。将400μl混悬液加入电转槽(electroporation cuvettes)，确认没有气泡。设定电压为450V，脉冲时间为110ms，脉冲次数为1；进行电穿孔转染。电转后将槽内的混合物转入预先加入DMEM+10％FBS的55mm和35mm培养皿各一部分。

4.2Western Blot 检测：转染72h后，分别收集COS-7细胞和转染bFGF的COS-7细胞各10⁶及其培养上清液。SDS煮沸法裂解细胞并收集上清，与细胞培养上清液合并真空冷冻干燥，浓缩至1/3体积。制备10％丙烯酰胺电泳凝胶。分别上样，200V恒压电泳40min。电泳结束取出凝胶，100V恒压转膜60min，将蛋白印迹于硝酸纤维素滤膜。用兔抗bFGF多抗进行免疫染色，DAB显色。

5.bFGF活性测定

复苏PC12细胞，培养于含10％FBS和5％马血清的DMEM中。48h后将COS-7细胞和转染bFGF的COS-7细胞上清液与培养液按1:1的比例加入PC12中，观察其生长状况。

结果

1.RT-PCR扩增产物的获得

提取人胶质母细胞瘤细胞系BT325总RNA，逆转录得到cDNA第1链，用合成的bFGF上、下游引物进行PCR反应，得到约 480bp 的特异性片段(图1)。图1RT-PCR产物的电泳分析结果

1.bFGF cDNA2.pBR322/Hinf I 分子量标准(bp)

Fig.1Electrophoresis analysis of RT-PCR product.

1.bFGF cDNA2.pBR322/Hinf I marker(bp)图2pGEM-bFGF 酶切产物的电泳分析结果

1.pBR322/Hinf I 分子量标准(bp);2～5.pGEM-bFGF/EcoR I、Xba I

Fig.2Electrophoresis analysis of enzymatic result of pGEM-bFGF.

1.pBR322/Hinf I marker(bp);2-5.pGEM-bFGF/EcoR I，Xba l图3pCI-neo-bFGF 酶切产物的电泳分析结果

1～3.pCI-neo-bFGF/EcoR I Xba I;

4.pBR322/Hinf I分子量标准(bp)