【中图分类号】Q189【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)-增-25

THERAPEUTIC GENES IN EXPERIMENTAL STUDY ON GENE THERAPY FOR PARKINSON DISEASE

帕金森病(PD)的主要病理特征为中脑黑质多巴胺能神经元变性缺失，临床 表现有静止性震颤、肌强直、运动减少和姿势反射障碍等。目前的治疗措施以左旋多巴(L- 3，4-dihydroxyphephenelalanine,L-DOPA)为主，但存在后期无效、不能阻止疾病进展及 震 颤等问题。其他治疗措施如向脑内植入能产生多巴胺(DA)的细胞(如肾上腺髓质 细胞和胚胎多巴胺能神经元)也有一定的疗效，但因存在存活、疗效、细胞来源及伦理等问 题难以在临床推广^［1］。从80年代开始，人们积极探索各种基因治疗PD的手段，包 括向 脑内移植能提高纹状体DA水平的各种酶(如酪氨酸羟化酶)以及能促进黑质神经元存活的神经 营养因子等基因的各种运载细胞，或将这些基因通过病毒性载体直接注入脑内^［2］ 。许多研究证明，上述不同基因治疗方案都能在不同程度上改善动物行为症状或有助于中脑 神经元结构功能的恢复。

帕金森病(PD)的主要病理特征为中脑黑质多巴胺能神经元变性缺失，临床 表现有静止性震颤、肌强直、运动减少和姿势反射障碍等。目前的治疗措施以左旋多巴(L- 3，4-dihydroxyphephenelalanine,L-DOPA)为主，但存在后期无效、不能阻止疾病进展及 震 颤等问题。其他治疗措施如向脑内植入能产生多巴胺(DA)的细胞(如肾上腺髓质 细胞和胚胎多巴胺能神经元)也有一定的疗效，但因存在存活、疗效、细胞来源及伦理等问 题难以在临床推广^［1］。从80年代开始，人们积极探索各种基因治疗PD的手段，包 括向 脑内移植能提高纹状体DA水平的各种酶(如酪氨酸羟化酶)以及能促进黑质神经元存活的神经 营养因子等基因的各种运载细胞，或将这些基因通过病毒性载体直接注入脑内^［2］ 。许多研究证明，上述不同基因治疗方案都能在不同程度上改善动物行为症状或有助于中脑 神经元结构功能的恢复。

1.帕金森病基因治疗策略

鉴于PD主要是由于合成DA递质的黑质多巴胺能神经元丢失造成其靶结构纹状体中DA含量下降 所致，因此对PD的基因治疗可在两个水平进行，即一方面将编码DA生成或代谢的酶类基因 导入纹状体以增加DA的局部含量；另一方面，则可将营养因子基因导入黑质纹状体系统以减 慢或阻止DA神经元变性的进程^［2］。

向黑质纹状体导入治疗基因通过间接体内(回体)(ex vivo)和直接体内(in vivo)两 种方法。 前者是在体外用携带治疗基因的表达载体转染培养细胞后再移植于脑内，后者是将携带目的 基因的表达载体直接注射于脑内，以达到治疗PD的目的。

一般用于体外转基因的表达载体为真核表达质粒和逆转录病毒。质粒的基因输送系统包括裸 DNA、阳离子脂质体、阳离子聚合体^［2］。阳离子多肽(如多聚甘氨酸)和带负电荷DN A结合后与细胞表面的特异性配体如转铁蛋白或胰岛素相互作用并诱发胞吞作用，使DNA转运 至细胞内。阳离子脂质可浓缩并包裹DNA于正电荷复合体(脂质体)中，也可由胞吞介导进入 细胞^［2］。逆转录病毒载体来自经过改造的小鼠白血病病毒，这种载体可容纳长达8 .0kb的外源DNA序列，其克隆质粒中已被去除了原来表达病毒成分的基因如env、gag、pol 等 ，只保留了病毒的逆转录及原病毒转录的控制序列LTR以及病毒的包装信号ψ。重组病毒感 染(转导，transduction)细胞后，其RNA逆转录形成的DNA即原病毒可以稳定地整合于细胞基 因组中，使外源DNA在细胞中得到稳定表达^［2］。但其只能转导分裂期细胞，从而限 制了其在非增生细胞如肝细胞、肌纤维、造血干细胞和神经元等细胞中基因转移的应用。可 用来表达外源基因的运载细胞很多，如成纤维细胞、成肌细胞、多能骨髓基质细胞、肿 瘤细胞系、胶质细胞和神经干细胞^［1］等均有应用。

直接体内的转基因载体多用病毒性载体，如腺病毒(adenoviral vector,Ad)、 腺相关病毒(adenoassociated viral vector,AAV)、单纯疱疹病毒(herpes si mplex virus vector,HSV)、慢病毒(lentiviral vector)等。这 些重组病毒可在注射局部感染细胞并使之表达外源基因以达到治疗的目的。另外，也有用质 粒直接脑内注射的报道。

2.治疗基因Ⅰ--影响多巴胺合成途径的酶类基因

2.1酪氨酸羟化酶(TH)：TH是DA合成通路上的限速酶，但作为蛋白，它不能直接 被细胞所吸收。将表达外源TH的遗传修饰细胞植入或将TH基因直接注入纹状体，是目前基因 治疗PD的主要策略。

将转有TH基因的大鼠成肌细胞移植于PD模型大鼠纹状体后，能纠正模型动物的不正常旋转行 为达50%～60%，疗效可维持13个月以上，移植后纹状体内DA含量可达到正常水平的49%、是 未治疗时的25倍，未见肿瘤形成，免疫排除反应不明显^［3］。将GFAP启动子驱动的T H 表达载体与脂质体的混合物直接注入PD大鼠纹状体，经过GFAP和TH免疫双标处理后在激光共 聚焦显微镜下观察，可见TH特异性表达于神经胶质细胞，动物旋转行为改善^［4］ 。为了提高质粒直接注射后基因的表达水平，将牛乳头瘤病毒改造的TH和AADC(左旋芳香氨 基酸脱羧酶)表达质粒向PD大鼠纹状体连续注射7d，动物行为改善达5个月之久，且共转染效 率比单一TH的要好^［5］。用HSV介导的TH基因转染PD大鼠纹状体后，动物行为改善 和生化代谢(包括纹状体TH酶活性和细胞外液DA浓度)好转可持续1年^［6］。

2.2GTP环化水解酶(GTP cyclohydrolase I,GTPCHI)：6-四氢碟吟(tetrahydropete rin ,BH4)是TH的辅助因子，而GTPCHI是合成BH4过程中的限速酶。由于单胺能神经元以外的细胞 中B H4含量较低而不足以激活TH的活性^［7］，因此在TH、GTPCHI共表达的纹状体组织中 ，L-DOPA含量会比单一转染TH时明显提高。用AAV介导的TH、GTPCHI转染PD大鼠纹状体后，3 周可见TH表达，6个月后表达降低；用神经元标记物NeuN染色表明，90%以上的AAV-TH阳性 细 胞为神经元。微透析分析表明，GTPCHI和TH共表达的动物L-DOPA水平升高明显(4～7μg/L) ， 且不依赖于外源性BH4的供应，但动物的旋转行为没有明显变化；而单转染TH的动物只有在 获得外源BH4的情况下才可检测到L-DOPA(1～4μg/L)^［8］。

用TH和GTPCHI重组逆转录病毒转染大鼠胶质肉瘤9L细胞、原代培养成纤维细胞^［9］ 、大鼠和人的多能骨髓基质细胞^［10］后移植于PD大鼠纹状体，微透析分析表明共转 染细胞移植组的纹状体L-DOPA比TH单一转染组明显高，但是转基因成纤维细胞对外源基因 表 达呈进行性降低，移植后第5周已完全检测不到转基因的表达，说明成纤维细胞对转基因的 长期表达效果不理想；转基因骨髓基质细胞存活87d，但转基因表达只有9d，动物的旋转行 为得到改善，共转染组与单TH转染组间没有显著性差别。

2.3左旋芳香氨基酸脱羧酶(aromatic amino acid decarboxylase,AADC):在DA合成过 程中，需 由酪氨酸经TH催化形成L-DOPA，再经AADC对之脱羧而形成神经递质DA。研究发现，在帕金 森 病的纹状体中，内源性AADC含量甚微、活性很低^［11］。因此，单独补充TH基因的治 疗效果可能受到限制。已有研究证明，AAV介导的AADC基因在大鼠纹状体转移后，再全身给 予L-DOPA的情况下，其纹状体内的脱羧能力提高并能维持6个月，转入酶的基因表达在1年 以 上。其优点在于通过调节L-DOPA的剂量达到调节DA含量的目的，这与TH或TH-AADC联合治 疗 不同，后两者不能得到可调节的DA输送方法^［12］。用TH和AADC共表达的AAV载体转 染MPTP诱发的PD模型猴纹状体，TH表达可达134d，沿注射通道见DA水平升高，但行为上没有 明显改变。用此种载体后，动物有发热和偶见的过敏反应，但组织学上未见炎症反应^{［ 13］}。

3.治疗基因Ⅱ--多巴胺重吸收转运蛋白(小泡单胺类转运体)

现已知，长期使用L-DOPA药物治疗PD会出现效果降低(wearing-off)的现象和 运动障碍，其部分原因是DA能神经末梢丢失后不再调节DA的稳定释放。

小泡单胺类转运体(vesicular monoamine transporter,VMAT)位于神经末梢的突触囊泡膜上 ，可将内源性DA从胞质运至小泡内贮存^［14］。在两类VMAT中，VMAT2主要位于脑内 ，对儿茶酚胺类的亲和性高于VMAT1。VMAT2在没有突触小泡的非神经元细胞( 如成纤维细胞)中也能起到单胺类转运体的作用，即可将DA贮存于酸性胞内体(endosome)中 ^［15］，需要时能稳定而缓慢地释放出来。实验证明，将原代培养的成纤维细胞用VM AT-2和AADC重组逆转录病毒转染后再移植到PD大鼠纹状体内，在全身性给于L-DOPA的条件 下 ，发现DA在纹状体内的水平比单一转染AADC基因的动物持续时间长，能明显提高L-DOPA全 身 给药后纹状体内DA水平，这恰好能解决L-DOPA药物治疗PD时出现的副作用，包括药物作用 持续时间短、出现运动障碍等^［16］。

4.治疗基因Ⅲ--神经营养因子

上述TH、GTPCHI、AADC、VMAT-2等参与DA代谢的酶类或蛋白基因对帕金森病有对 症治疗作用，而利用GDNF、BDNF和bFGF等神经营养因子基因则具有营养DA能神经元的作用， 它们对PD的治疗作用体现在保护神经元的结构和功能方面。

4.1胶质细胞系源性神经营