【中图分类号】R322．8；Q343．1【 文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000）-增-21

GENE TARGETING AND ITS APPLICATIONS IN NEUROBIOLOGY1．基因打靶概述分子生物学的方法证明，能在细胞内稳定遗传的外来基因是以两种方式整合于某一染色体上的，一是随机整合，二是定向地整合于基因组DNA的特定位点上。第2种方式即为基因打靶^［1］。

基因打靶是80年代发展起来的新技术，是一种通过同源重组按预期方式改变生物活体的遗传信息的实验手段，亦称为基因定点同源重组。

活细胞染色体DNA与外源性DNA间的基因重组可为同源重组，也可为非同源重组。外源DNA片段大且同源性强者与宿主基因片段互补结合时，结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换的可能，称为同源重组。基因打靶选择的特定位点在基因的同源区。

小鼠胚胎干细胞(ES细胞）具有特殊且重要的生物性能。它源自小鼠早期胚胎的内细胞团，能在体外培养并保留发育的全性能。在体外进行遗传操作后，重新移植回小鼠胚胎，可发育成胚胎的各种组织。基因打靶技术结合这种ES细胞系统，已经产生了数百种带突变基因的转基因小鼠，使研究者得以从生物整体上研究高等动物基因表达、调控及生理功能，并用来研究人类疾病的分子机制和用作人类疾病的动物模型。

基因打靶的主要步骤：

(1）重组基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因、tk基因）的载体上。此重组载体即为基因打靶载体。

(2）用电穿孔、显微注射等方法把上述重组DNA转入受体细胞核内。显微注射法命中率较高，但技术难度大；电穿孔命中率低，但易于操作。

(3）用选择性培养基筛选已击中的细胞。正负选择法双向选择，剩下的细胞为命中细胞。

(4）观察被击中细胞的生物学特征：将已击中的胚胎干细胞转入胚胎使其生长，对转基因动物进行形态学及分子生物学检测。

采用不同的策略进行打靶载体的构建，不仅能简单地使基因失活，而且能将更精细的突变引入ES细胞染色体中，如基因敲除(gene knock out）、“打了就跑”( hit and ran ）、双置换法(in-out ）^［2］、基因敲入(gene knock in ）^［3］。其中基因敲除及基因敲入是最常用的策略。基因敲除的打靶载体上设有一段与欲灭活的靶基因有高度同源性的 外源基因。比较“敲除”掉某基因鼠与正常鼠的各种生物功能，为基础科研提供了方便的动物体系。在基因敲除转基因鼠的研究中，发现了一些令人惊异的现象，一些原被认为功能十分重要的基因被“敲除”后，其表型仍表现正常，提示基因产物间存在着人所未知的更复杂的相互关系，这种关系决定了一种蛋白的功能。由于传统基因敲除技术制造的某些基因的简单失活常常导致令人费解的无改变的表型，一种新方法“基因敲入” 法应运而生，以证明某些基因取代了被敲除的靶基因的功能。

基因打靶技术是80年代后期发展起来的新兴的分子生物学技术，具有定位性强、打靶后新的基因有随染色体DNA稳定遗传的特点，具有广阔的应用前景。

神经系统基因表达模式有明显的区域性。不同的神经元具有产生不同神经递质及其受体的酶系。其他的蛋白质分布更广泛，如中间丝蛋白质神经丝或胶原纤维酸性蛋白质 或普遍存在的粘附分子、神经细胞粘附分子和整合素^［4］，它们在神经系统之外也有丰富的表达。因此，基因打靶能影响这些神经元的生物学特征，而表达基因的缺失能有更严重的基因表型结果，包括胚胎致死。如基因打靶在csk位点可导致神经管缺陷和胚胎死亡^［5］。基因打靶在神经调节蛋白基因位点其表型是施万细胞前体和脑神经节缺失、心脏畸形、胚胎死亡^［6］。

基因打靶技术近期令人兴奋的进展是由Cre介导的loxP特异重组^［7］。该系统允许进行时空控制的遗传修饰应用Cre-loxP技术，通过基因敲除克服早期胚胎死亡，在胚胎发育后期研究基因失活作用。可应用Cre-loxP技术产生特异顺序的基因敲除，例如具有不同组织分布和功能的剪接变体。

2．小鼠无效突变体

目前，在胚胎干细胞应用同源重组的基因打靶是一项广泛采用的技术^［8］。用打靶载体转染多能胚胎干细胞，并将以同源重组进行基因打靶的细胞注射进胚泡，这些细胞能对组织发挥作用。

设计基因打靶策略时，要考虑许多参数。应用若干千碱基同源DNA进行基因打靶大大增加了胚胎干细胞基因打靶效率^［9］。研究者已从基因组129／SV文库中克隆了许多整合素(integrin）基因并成功进行了基因打靶。图1给出2个能应用的打靶载体的例子。含有ATG开始密码的关键外显子(图1a）可被打靶载体选择性标志物置换(图1b）。换言之，将可选择性标志物置于外显子内侧(图1c）。多数情况，在普遍存在的启动子如小鼠蛋白激酶-1启动子(PKG-1）的控制下，使用潮霉素^［10］或新霉素^［11］抗性基因进行基因打靶。打靶位点含有一个选择标志物时，内源基因的转录受到干扰。已有许多文章报道同源重组，将单纯泡疹病毒(HSV）胸腺嘧啶蛋白盒置于结构的末端^［12］，允许对任意整合事件的负选择，常规应用没有上述盒的结构。研究者使用的结构由3～7千碱基的同源顺序，侧翼有选择性标志物盒，基因打靶效率从10％达60％，但同源重组效率可以取决于序列、甲基化或染色质结构。

图1示2个不同基因打靶载体产生的小鼠基因

a.1个或更多关键外显子将使基因失活

b.含有ATG开始密码的外显子和部分启动子被PGK-neo-(A）n盒 置换

c.将同样的盒引导入外显子，防止内源基因的转录，选择剪切可形成部分功能基因产物

3．Cre-loxP系统在外显子特异的基因敲除 小鼠中的应用

小鼠的基因打靶经常导致胚胎死亡^［13］。与此相反，其他情况未观察到明显的表现型。以调节发育的方式表达的特异剪接变体可能不需要完全的基因破坏。此时，特异外显子的基因敲除可达到此目的。从图1可见，不能使用外显子缺失由选择性标志物替换的打靶载体，因为这将导致完全的基因敲除。需要更精密的方法，应用Cre-loxP系统。Cre是38kD重组酶蛋白，由大肠杆菌噬菌体P1编码。它能识别loxP，1个34bp序列，含有2个13bp反向重复片段，由8bp间隙分隔开,它们一起形成Cre重组酶的两个连接位点^［14］。假如两个loxP位点存在于DNA片段，Cre介导的重组可能导致倒位或去除loxP侧翼DNA片段。Cre介导在loxP位点特异位点的重组已在原核细胞中广泛研究^［15］，也在哺乳动物离体细胞中进行了观察。Cre的表达导致了在loxP位点的重组，并且去除了loxP侧翼的序列，明确了真核细 胞体系也能应用基因打靶方法。

图2a表明外显子特异的基因敲除策略。打靶载体由同源序列组成，缺失的外显子将被新霉素抗性基因(neo^r-tk）盒替换(图2b）。 打靶载体整合到基因组，将参照G418对转染胚胎干细胞的抗性(图2c）。应用Southern blot分析已被确定的同源重组的克隆。这些细胞以编码Cre重组酶的质粒瞬时转染(图2d）并在含有丙氧鸟苷不含G418的培养基中培养。Cre介导的重组出现后，neo^r-tk盒从基因中被切除，在内显子内保留了loxP位点(图2e）。这些克隆不再表达tk并且不受丙氧鸟苷存在的影响。Southern blot分析证实选择性克隆具有正确重组。必须进一步检查Cre编码的质粒未被整合入基因组。胚胎干细胞克隆满足如下的要求，即基因组内打靶等位基因内，外显子和某些上游及下游序列由loxP位点置换。将这些细胞注射入胚泡。此基因位点的转录将最终导致信息变异体缺少1个外显子。在小鼠IgH基因应用此方法成功地去除JH片段和内显子增强子。在杂合子小鼠的B细胞，在μ基因开关区域开关重组的诱导导致免疫球蛋白同种型极大减少^［16］。

图2特异外显子基因敲除策略

a.含有6个显子(1～6基因编码蛋白质，将去除外显子3

b.以neo-tk盒代替基因打靶载体外显子3，其两侧翼有同样方向的loxp位点(实体三角形）

c.同源重组使胚胎干细胞具有等位基因

d.编码Cre重组酶质粒瞬时表达将导致在loxp位点重组和neo-t k盒的去除

e.应用含有重组等位基因胚胎干细胞注射入胚泡，产生纯合子突变小鼠，基因转录产生截短的信使和突变蛋白质

上述方法可用于使脑来源神经营养因子(BDNF）基因座特异外显子缺失。作为替换剪接和聚腺苷酸化的结果，8个不同的mRNA由BDNF基因转录，也找到多个启动子区域的证据。证明剪接变异体有不同的表达。发现变异体在心脏和肺组织内含有外显子Ⅰ～Ⅲ，用红藻氨酸处理后其表达被上调。发现变异体在心脏和肺组织