【摘要】目的探讨肝树突状细胞(hepatic dendritic cell, HDC)的 生 物免疫功能及在肝移植耐受中的作用。方法分别从肝脏和骨髓分离、 培养DC，以免疫组织化学及 流式细胞术检测两种DC生物特性及免疫活性的差异。结果培养6～8d， 骨髓DC (BM-DC)有大 量细胞从集落中释放，并呈成熟状态，细胞表面组织相容性抗原MHC class I、 MHC class II及共刺激分子CD80(B7-1)、CD86(B7-2)都有较高水平表述，混合淋巴细胞反应(MLR)中 表现出有强烈刺激 T 细胞增生的能力；而同时期的 HDC 具有非成熟 DC 的形态及功能特征 ，表面分子表达很低，无刺激 T 细胞增生的能力。结论实验结果提示 HDC 具有 BM-DC不同的生物特性可能是产生肝脏移植受特性的一个重要原因。

【中图分类号】R392.4【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)增-81

In vitro COMPARATIVE RESEARCH OF DENDRITIC CELLS DERIVED FROM LIVER AND BONE MARROW

FU Ji-dong，ZHONG Cui-ping*, WANG Guo-qiang, FAN Qiang，GU Y un-di，ZHANG Xin-hua

(Department of Histology and Embryology, Shanghai Medical University,Sh anghai 200032, China)

【Abstract】Objective To investigate the biological character istics of hepatic de ndritic cell(HDC) and its functions in the immune tolerance of hepatic allograft s. Methods DC progenitors were respectively isolated from liver and bone marrow o f C57BL/6 J mice, and were propagated in liquid culture with GM-CSF. The immune fu nction was detected by using immunochemical staining, FCM and MLR. Resu lts Afte r 6-8 days' culture, most BM-DC released from proliferating aggregates. They e xp ressed high level MHC classⅡ and costimulating molecules CD80 (B7-1),CD86(B7- 2),and the ability for strongly stimulating T cell proliferation, which showed the stro ng mature features. But HDC expressed lower level of those molecules, and failed in inducing primary allogeneic responses of naive T cells, Conclusion These obs ervations demonstrated that liver-derived DCs have the bio-function of immatur e DC, which may contribute to the immune tolerance of hepatic allografts.

【Key words】Liver; Dendritic cell (DC); Immune tolerance肝脏因其固有的移植耐受性而在免疫耐受研究中受到关注，肝移植物容易形成耐受，肝移植术的成功率也很高，据美国 Vichow 医院 1993 年统计，其452 例肝移植的1年、5年生存率分别为90.2％和82.8％。不仅如此，伴有肝移植的其他器官(如心脏、肾脏等)移植存活时间也较其单独移植明显延长。另外通过肠吸收或门静脉注射的抗原同样易形成免疫耐受，这表明肝脏有其独特的免疫耐受性。

最近美国彼兹堡大学的 Thomson 和 Lu ^［1］提出在肝移植耐受中树突状细胞(dendritic cell, DC) 可能起关健作用，输入肝脏来源的树实状细胞 (hepatic dendritic cell, HDC)能延长移植物的存活期，而输入骨髓来源的 DC (BM-DC) 则无此效果^［1］。又有人提出 HDC 诱导T 细胞分泌 Th2 型细胞因子 IL-4、IL-10，而 BM-DC 诱导 T 细胞分泌 IFN-r等 Th1 型细胞因子^［2］。那么这两种细胞的生物特性之间存在什么样的差异?为此，我们将两种来源的DC在相同条件下进行体外培养，对两种 DC 的生长发育、生物学特征及免疫学功能进行初步探讨。

材料和方法

1.动物

8～10周 C57BL/6J 小鼠(H-2K^b，I-A^b，I-E^-)，C3H/HeJ 小鼠(H-2K^k，I-A^k，I-E^k)购自中国科学院动物中心上海分中心。

2.材料

前灌流液(Hanks 液含肝素 500IU/100ml)、PBS液、DBS液、PBA(PBS+0.1％叠氮钠+2％小牛血清，pH为7.2)。RPMI 1640 完全培养基：由 RPMI 1640 干粉 10.4g/L(购自 GIBCOL公司)、HEPES 2×10^-2mol/L、L-谷氨酰胺2×10^-3mol/L、2-巯基乙醇0.05mol/L、非必需氨基酸0.1mol/L、丙铜酸钠1mol/L、双抗(青霉素100IU/ml、链霉素0.1g/L)和10％灭活的胎牛血清(购自GIBCOL 公司)构成。细胞分离液 Percoll 购自 Pharmacia 公司，鼠重组 GM-CSF(mrGM-CSF)为 GIBCOL 公司产品，IV胶原酶为 Sigma 公司产品。丝裂霉素C为日本 Kogyo 公司产品，³H-TdR为上海原子核研究所产品。大鼠抗小鼠 H-2^b、I-A^b、B7-1、B7-2等单抗、羊抗大鼠二抗及 StrepAvidin-Cy3、FITC标记的羊抗大鼠二抗购自Pharmingen 公司。

3.DC的分离、培养

3.1HDC 的分离、培养：C57BL/6J 雌性小鼠50只，戊巴比妥钠麻醉，无菌开腹，门静脉插管。两步法灌流后取材^［3］，放入0.05％的IV胶原酶液中体外消化30min。尼龙网过滤，用DBS液清洗两次，稀释成4～5ml细胞悬液。用细胞分离液 Percoll 不连续密度梯度离心后，吸取两液体界面的肝非实质细胞，清洗两次，调整细胞浓度为2.5×10⁶/ml，接种于24孔培养板，每孔1ml，加 mrGM-CSF 20μg/L，隔天筛选换液。

3.2BM-DC 的分离、培养：C57BL/6J 雌性小鼠50只，颈椎脱臼处死，无菌取双侧股骨和胫骨，用 Hanks 液冲洗出骨髓，制成细胞悬液，清洗后破血去红细胞膜，用RPMI 1640 完全培液调整细胞浓度为 2×10⁶/ml^［4］，接种于24孔培样板，每孔1ml，加入细胞因子 mrGM-CSF 20μg/L 隔天筛选换液。

分别在不同天数收取以上两种细胞，制成细胞甩片或细胞涂片，-20℃保存备用，并作部分 Gimesa 染色片。

4. T细胞的分离及与DC的混合培养

取C3H/HeJ 雌性小鼠6只，无菌开腹取脾细胞，清洗破血去红细胞膜后，制成 1ml 细胞悬液，尼龙毛柱分离 T细胞，调整细胞浓度至2×10⁶/ml备用。

收集培养4、7、10d的BM-DC与HDC，丝裂霉素 C 处理后 (25g/L，37℃水浴 30min)，1640洗3次，调整细胞浓度为2×10⁵/ml备用。取DC和T细胞各0.1ml，加入96孔培养板作混合培养，同时设单一T细胞孔和单一DC孔作对照，培养72h。收集细胞前16h每孔加³H-TDR 0.5UCi，用多头细胞收集仪收集细胞至玻璃纤维膜上，烤干纤维膜，放入闪烁液中，用β液闪计数仪(Beckman LS 6500, USA)测 cpm 值。

5.细胞免疫组织化学检测细胞特性

取-20℃冷藏细胞甩片或细胞涂片，复温后用冷丙酮固定10min，干燥后用0.01mol/L PBS洗两次，每次5min，按常规免疫组织化学染色方法依次用0.03％的H₂O₂、Avidin 液、Biotin 液、1％BSA 封闭；加一抗 H-2^b、I-A^b、B7-1、B7-2 和相应 Biotin化的二抗，再加 ABC 复合物及 DAB 显色，以上各步骤间均以PBS液洗3次，最后脱水封片。每种一抗均以相应的同型(isotype)抗体染色作阴性对照。

6.流式细胞仪(FCM)检测细胞表型

收取培养7d的 BM-DC、HDC与培养10d的HDC 制成细胞悬液，每管细胞为0.5～1×10⁶，加 Fc抗体 2μl(4℃，10min) 以去除非特异性荧光吸附；加单抗，室温避光孵育30min用PBA 洗液清洗；再加有荧光素标记的二抗(StrepAvidin-Cy3 或 FITC-IgG)，室温避光染色30min，用PBA 洗液清洗2次，弃上清；加入0.5ml PBA 细胞洗液混匀，上机(FACS-Colibar, Becton Dickinson Oxnard, CA)检测。

结果

1.分离培养 DC的光镜观察

每只小鼠能分离出骨髓细胞约3.5～4.0×10⁷个，包括造血干细胞及内皮细胞、成纤维细胞等。经24h培养后，在贴壁细胞表面有许多集落出现，以粒细胞集落居多，48h后筛选吸弃悬浮的集落细胞，剩小部分半贴壁半悬浮的DC集落存在，到第4d时，此类半贴壁集落数量剧增，集落表面的细胞可见有长短不一的突起(图1)。继续培养至6～8d，集落丰富，并开始有大量细胞从集落中释放出来(图2)，释放的细胞突起较长。细胞涂片 Gimesa 染色可见细胞核偏位，突起较多。

每只小鼠从肝脏可分离得到约1.0～1.5×10⁷个肝非实质细胞，细胞大小不一，类型较多。培养24～48h后，有大量贴壁细胞贴壁生长，少量HDC前体细胞半贴壁状散在分布，经筛选、扩增培养，第4d时 HDC 数量增多，但并未形成明显集落(图 3)。第7～8d，HDC 数量较多，并有部分细胞悬浮，悬浮细胞有小的突起，同时在此阶段细胞有一明显的增殖高峰，出现大量半贴壁半悬浮的集落，集落表面的细胞有小的突起(图 4)。第10d起，集落依然大量存在，并有部分细胞从集落上缓慢释放，细胞涂片 Gimesa 染色见细胞核偏位，胞质内有大量的囊泡结构。每只小鼠在第7～8d HDC 的得率约为 2～3×10⁶个。

2.混合淋巴细胞增殖反应(MLR)

培养第4d C57BL/6小鼠的 BM-DC 仅轻度促进 C3H 小鼠T细胞的增生，第7d BM-DC刺激 T 细胞增生的能力增强，刺激指数约为9～10；培养7d HDC 无刺激 T 细胞增<