【中图分类号】Q255【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)增-09

MOLECULAR MARKERS FOR THE DETECTION OF APOPTOSIS

凋亡(apoptosis)是一种无论从形态表现还是发生机制上均明显区别 于坏死的细胞死亡方式，它是多细胞生物个体发育过程中细胞选择性死亡的基本形式，也参 与生理状态下多余或受损细胞的清除，以维持细胞增殖与死亡之间的动态平衡^［1］ 。正常凋亡过程的受抑或异常启动是多种疾病发生的病理学基础，如肿瘤、自身免疫病、退 行性疾病等。因此，阐明凋亡发生和调控的分子机制，对于充分揭示和有效干预病理状态下 的细胞增殖或死亡具有重要意义。与凋亡过程分子机制研究进展迅速，不断有新的调控因子 被发现相比，对凋亡发生过程的检测，尤其针对体内复杂的生理或病理条件下细胞凋亡现象 的识别，至今仍缺乏一个全面准确的评判标准。为此，我们在概括地描述细胞凋亡的信号传 递途径、典型表征出现的分子机理的基础上，详细介绍凋亡标志的研究进展及相应检测手段 ，为实际应用提供参考。

凋亡(apoptosis)是一种无论从形态表现还是发生机制上均明显区别 于坏死的细胞死亡方式，它是多细胞生物个体发育过程中细胞选择性死亡的基本形式，也参 与生理状态下多余或受损细胞的清除，以维持细胞增殖与死亡之间的动态平衡^［1］ 。正常凋亡过程的受抑或异常启动是多种疾病发生的病理学基础，如肿瘤、自身免疫病、退 行性疾病等。因此，阐明凋亡发生和调控的分子机制，对于充分揭示和有效干预病理状态下 的细胞增殖或死亡具有重要意义。与凋亡过程分子机制研究进展迅速，不断有新的调控因子 被发现相比，对凋亡发生过程的检测，尤其针对体内复杂的生理或病理条件下细胞凋亡现象 的识别，至今仍缺乏一个全面准确的评判标准。为此，我们在概括地描述细胞凋亡的信号传 递途径、典型表征出现的分子机理的基础上，详细介绍凋亡标志的研究进展及相应检测手段 ，为实际应用提供参考。

1.凋亡信号传递的基本过程

大量的研究结果表明，凋亡是一个由适宜刺激启动、细胞内多种蛋白成分参与 并且受到精细 调控的主动过程。尽管对于不同刺激或者不同的细胞类型，凋亡信号传递通路上的某些具体 环节不尽相同，但是从凋亡发生的总体趋势上看，可以将其划分为以下3个阶段^［2］ ：

1.1启动期：凋亡刺激信号通过中介激活起始caspases。以研究得比较清楚的Fas(CD95 ) 死亡受体为例，Fas配体与膜受体Fas的特异结合，通过中间蛋白FADD(Fas-associated dea th domain protein)使胞浆内的caspase-8由无活性的酶原转化为活性酶。

以caspase-8为代表的起始或上游caspases一旦活化，除继续传递凋亡信号给下游的caspas e s之外，本身作为蛋白酶开始对细胞骨架蛋白及其相关蛋白进行水解切割，后者包括Vimenti n、Actin、Fodrin等，使细胞呈现凋亡早期的形态学变化，如细胞皱缩、“大疱”形成。另 外，caspase-8还通过作用于某些膜酶类，改变膜脂质的分布状态，使正常存在于膜胞浆 侧的磷酯酰丝氨酸翻转向外暴露于膜表面，有关机制后有详述。

1.2决定期：起始caspases活化下游caspases，凋亡过程不可逆转。位居下游的caspas es ，如caspase-3、6和7，尤其caspase-3的活化是凋亡发生分子通路上的关键环节，无论从 死 亡受体起始，还是通过线粒体途径启动凋亡，均在此汇聚，即caspase-3由酶原转化为活性 酶。caspase-3等下游caspases具有自催化和它催化的特点，以此形成正反馈环路，使凋亡 信号呈级联式放大。

凋亡信号通过线粒体的传递途径包括两种因子由线粒体释放入胞浆，一是AIF(apoptosis in itiating factor)，它一种分子量为50kD的蛋白酶，除了能使下游caspases活化外，还参与裂解DNA。另一种促凋亡因子是细胞色素C(也称Apaf 2)，它在胞 浆中作用于Bc1-2/Apaf-1/caspase-9前体复合物，使Apaf-1脱离Bc1-2的抑制 ， 在ATP的辅助下，裂解caspase-9酶原生成有活性的caspase-9，后者进一步激活caspase- 3。

1.3执行期：活化的下游caspases对靶蛋白进行切割，细胞呈现凋亡的典型形态学改变 。下 游caspases，或称执行caspases一经活化，即作用于细胞内与细胞生存密切相关的多种结构 和功能蛋白质，后者的瓦解或者失活，使细胞表现出一系列特有的形态学变化和生化特征。 (1)参与DNA修复的PARP［Poly(ADP-ribose)polymerase］失活，同时DFF、CAD等核酸内切 酶 的活化，使DNA在核小体连接处被切割，产生成倍于180～200bp大小的DNA片段。(2)细胞骨 架蛋白及相关蛋白如actin、spectrin、PAK2等的降解，使细胞失去正常形态。(3)位于细胞 - 细胞、细胞-细胞外基质接触位点上的VMEKK-1、FAK等蛋白蛋激酶失活，使细胞失去与环 境 之间的联系，进一步加速凋亡进程。(4)涉及染色质结构及染色质与核基质相互作用的蛋白 质，如NuMa的受累，染色质发生凝聚，并沿核周呈块状分布。(5)核中间丝蛋白LaminA和B的 降解，使核囊结构解体。(6)转谷氨酰胺酶被诱导合成，并聚集于近胞膜处，催化微管微丝 蛋白的交联，在胞膜下形成牢固的蛋白分子支架，防止细胞内容物的外泄。

2.凋亡的标志及其检测方法

所谓凋亡标志，即能够表明凋亡而非其他形式的死亡，在一既定环境中发生的 特有指征。显然，与坏死膜结构肿胀崩解、内容物外泄截然不同的细胞皱缩、染 色体凝聚等 形态学改变，不仅是几十年前凋亡命名的依据，而且至今仍然是判定凋亡发生的金标准，对 新的凋亡标志物的评价也往往以上述形态学改变为参照。然而此标准在实际应用时往往遇到 问题，如形态学特征出现于凋亡过程的后期，凋亡细胞将被周围细胞吞噬清除，因此单纯以 形 态改变为依据往往低估了凋亡在细胞群体中发生的频率。另外，体内一些具有体积小、核质 浓聚等形态特征的细胞如多形核白细胞、少突胶质细胞，以及正处于分裂期的正常细胞，在 光镜下易与凋亡细胞混淆。因此，人们在对凋亡信号传递分子机制进行不断探索的同时，找 到了一系列凋亡的分子标志，其中几种已得到广泛的应用，现分述如下。

2.1核小体间DNA的切割

内源性核酸内切酶的活化发生于凋亡过程的早期，其作用对象乃染色质内高度螺旋卷曲、并 与核蛋白呈结合状态的DNA分子，因此切割作用只在有限的范围，即核小体间的连接处进行 ，产生一定长度的DNA片段。而细胞坏死时，溶酶体释放的核酸内切酶及外切酶共同作用于 结构松散的染色质DNA，产物为长短不一的DNA片段。就切割性质而言，凋亡DNA的切割类似D NA酶I样作用，缺口处的3羟基末端，是原位标记检测方法建立的基础^［3］。

2.1.1 DNA梯度：凋亡时发生在核小体间的DNA切割，经琼脂糖凝胶电泳，呈现出长度为18 0～200bp多倍体的阶梯样DNA谱带，而细胞坏死时DNA碎片则呈涂布式连续分布。此方法最 大的 缺点是不能对同时存在的凋亡和非凋亡细胞进行甄别，而且只有当凋亡细胞占有一定比例时 ，才能在凝胶上得到易分辨的DNA梯度。电泳前对DNA切割点进行酶促修饰，可以大大提高检 测灵敏度，减少样品用量，但应注意此修饰不应使DNA片段的长度发生明显改变而干扰对梯 度的观察。另外有报道，在某些细胞的凋亡过程中，并无核小体间DNA切割的发生^［4］ 。因此，DNA梯度的出现特异地提示凋亡发生，但是未见DNA梯度并不能完全排除凋亡。

2.1.2 DNA切割的原位显示：针对DNA切割后产生的断端，利用酶催化已标记的脱氧单核苷酸或者DNA片段连接其上，通过 标 记物显示切割发生的部位，候选酶类包括，模板非依赖性的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、E .coli DNA聚合酶I或其Klenow片段，以及T4DNA连接酶等，其相应的检测方法分别为TUNEL( TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling)、ISEL(in situ end labeling)及标记D N A片段的原位连接，其中以TUNEL最为常用。此类方法能够检测到尚未发生明显形态改变的凋 亡细胞，提高了检出率。

然而，DNA切割并不是凋亡特有的现象，也见于DNA复制、DNA可修复性损伤、细胞坏死等生 理或病理状态下。从理论上讲，TUNEL对凋亡的特异性高低取决于TdT的底物特异性和凋亡是 否具有特殊的DNA剪切方式。TdT选择性作用于单链DNA和双链DNA的3突出端，而对5突出 端 及钝性末端作用较弱，钴离子可以提高TdT对后两者的催化效率^［5］。就凋亡与非凋 亡 细胞DNA的切割方式有无区别，至今尚无定论，一般认为，核小体间DNA的切割方式是单链多 切口^［6］，因此推测存在着单链缺口和3种形式的双链断端，即3突出、5突出 及 钝性末端，事实上这些剪切形式均可出现于正常及坏死细胞中，然而据Didenko和Hornsby报 道^［7］，凋亡时出现 3单碱基突出末端，而在非凋亡情况下不出现或极少出现， 据 推测此现象与I型DNA酶样作用及凋亡时DNA的有限性剪切有关。显然，TdT对此末端缺乏特异 性。

TUNEL方法简单，敏感性强，尤其可以直接用于组织切片和进行定量检测，因此成为凋亡研 究的常用方法。但是在应用过程中应考虑本法对凋亡的特异性、方法本身的可靠性等因素， TUNEL阳性不能完全排除非凋亡DNA切割的可能性^［8］，而且操作处理不当，如蛋白 酶 消化过度、TdT过量、过氧化氢对组织的破坏等均可能导致假阳性出现^［9］。为此 ，除 了优化实验条件，设立适当的阳性及阴性对照外，应同时对阳性细胞进行形态学观察，排除 坏