【摘要】目的探讨胸腺素对下丘脑的作用机制。 方法RT-PCR和原位杂交组织化学技术。 结果RT-PCR检测结果表明，大鼠视前区有前胸腺素α₁-mRNA的表达； 原位杂交检测结果表明，下丘脑视前区大细胞核、室周核及视交叉上核部分神经元表达前 胸 腺素α₁-mRNA。此外，在第三脑室壁附近的小胶质细胞和皮层部分中、小型锥体细胞也 观察到前胸腺素α₁-mRNA的阳性信号。结论大鼠下 丘脑视前区以局部分泌形式产生前胸腺素α₁，提示前胸腺素α₁可能参与下丘脑功能的 调节。

【中图分类号】R338.2【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)-增-61

THE EXPRESSION OF PROTHYMOSIN α₁-mRNA IN PREOPTIC AREA OF RAT HYPOTHALAMUS

HE WeiWANG Xiao-haiHAN Xiao-ningGUAN Xiao-wei

(Department of Histology and Embryology,China Medical University,She nyang 110001;)

ZHANG Li-yan

(Department of Anatomy,Liaoning Institute of Basic Medicine,She nyang 110005,China)

【Abstract】ObjectiveIn order to explore the mecha nizms of thymosin action on hypothalamus.Methods RT-PCR and in situ hybridization histochemistry (ISHH)were used.Results The expression of prothymosin α₁-mRNA was detected in pre optic area of hypothalamus by using RT-PCR technique.The results of ISHH s howed that prothymosin α₁-mRNA was expressed in the preoptic magnocellular n ucleus,suprachiasmatic nuclei and paraventricular nuclei of hypothalamus.In addi t ion,the positive signal of prothymosin α₁-mRNA was also observed both in the microglicyte near the third ventricle and in medium to small sized pyramidal cel ls in cerebral cortex.Conclusion Prothymosin α₁ is produced i n preoptic area of the hypothalamus by means of paracrine,which indicates that prothymosin α₁ participates in the regulation of hypothalamic function.

【Key words】Prothymosin α₁-mRNA;Preoptic area of the hypothalamus;RT-PCR;in situ hybridization;Rat许多研究结果提示，胸腺与下丘脑-垂体-性腺轴关系密切 ［1］ 。在新生儿期切除胸腺的鼠或先天性无胸腺的裸鼠，其子宫和卵巢的成熟显著延迟，青春期 的出现受到抑制，但是胸腺移植可恢复卵巢功能^［2］。有学者^［3］用放射免 疫分析法证明，在下丘脑和垂体提取物中似有内源性胸腺素(thymosin)的存在，脑室内灌流 胸腺素能刺激小鼠下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)的分泌。Sakabe等^［4］报道， 在大鼠胚 胎早期下丘脑就存在胸腺素样免疫活性细胞。但是，下丘脑内的胸腺素是由胸腺分泌经血液 循环而来，还是在下丘脑以局部分泌方式产生，尚不清楚。一般认为，胸腺上皮细胞首先产 生前胸腺素 α₁(prothymosin α₁)，前胸腺素α₁经转录后的修饰过程，其N-端 乙 酰化，生成胸腺素α₁^［3］，从胸腺分泌入血。为探讨胸腺素对下丘脑-垂体-性 腺 轴的作用机制，本研究用RT-PCR和原位杂交组织化学方法观察了大鼠下丘脑促性腺激素释 放激素GnRH神经元胞体所在的视前区内前胸腺素α₁-mRNA的表达。

材料和方法

1.试剂和材料

RNA提取试剂盒购自美国QIAGEN；RT-PCR试剂盒、原位杂交用地高辛标记prothymosin α 1 合成寡核苷酸探针及GnRH合成寡核苷酸探针均购自日本TaKaRa；抗地高辛抗体(工作浓度1∶ 1 000)和碱性磷酸酶显色剂NBT/BCIP(工作浓度1∶100)购自美国LIFE TECH。

7周龄近交系雌性SD大鼠8只，为了排除性周期对实验结果的影响，进行卵巢切除。切除术1 周 后，戊巴比妥钠(40mg/kg)腹膜腔注射麻醉下，取4只鼠下丘脑视前区脑组织及胸腺，-70℃ 冷冻保存，用于RT-PCR；另4只鼠经左心室4%多聚甲醛灌流固定，取全脑，相同固定液后固 定48h(4℃)后，石蜡包埋，连续切片(厚8μm)，裱片，甲苯胺蓝染色进行核团定位后用于原 位杂交组织化学染色。

2.RT-PCR检测程序

提取视前区脑组织总RNA。作为prothymosin α₁的阳性组织对照，同时提取胸腺组织总RN A。用1μg RNA加20μl 的反应液(5 mmol/L MgC1₂，RNA PCR 缓冲液，1 mmol/L dNTP Mi xtur e,1×10⁶IU/L RNase Inhibitor,0.25×10⁶IU/L Reverse Transcriptase,2.5μmol/ L Random 9mers),30℃ 10min,50℃ 50min，进行逆转录。99℃ 6min使逆转录酶失活后， 脑组 织和胸腺组织的cDNA于-20℃保存，以进行PCR。根据大鼠 prothymosin α₁基因序列设 计 引物^［5］，上游：5’-ATGTCAGACGCGGCAGTGGA-CACCAGCTCCG-3’，下游：5’-G TCTA GTCATCCTCATCAG-3。由此对引物扩增出的DNA片段长339bp。PCR扩增条件是：94℃ 2min 预变性 后，94℃变性30s；64℃退火30s；72℃延伸1min；循环35次。最后经72℃延伸5min完成反应 。此外，由于GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase)几乎存在于所有细胞 中 ，为检测所提取的总RNA的完整性，设计了一对GAPDH 的 PCR引物^［6］。上游： 5’-CTCAA GATTGTCAGCAATGC-3’，下游：5’-CAGGATGCCCTTTAGTGGGC-3’。由此对引物扩增出的DNA片段长393bp。PCR扩增产物于1．5％琼脂糖凝胶电泳，0．5mg／L溴化乙锭染色后，紫外线观察并摄片。

3．原位杂交组织化学染色程序

脑片脱蜡至水后，2×SSC 60℃漂洗5min×2次，蛋白酶K(15mg／L）37℃孵育20min(于0．05mol／L Tris*HCl pH8．0；0．05mol／L EDTA缓冲液中）；0．01mol／L冷PBS漂洗5min×3次，在不含探针的预杂交液(50％去离子甲酰胺；5×SSC；5×Denhardt液；变性的鲱鱼精子DNA 100mg／L ）中孵育1h(37℃）后，切片在含有0．1mg／L地高辛标记的prothymosin α₁寡核苷酸探针的杂交液中37℃孵育过夜，相邻切片在含有0.1mg/L地高辛标记的GnRH寡核苷酸探针^{［ 1］}的杂交液中同样条件过夜。次日，4×→2×→0．2×SSC／30％formamide中各漂洗5min×2次(37℃），0．01mol／LPBS中5min×3次(37℃），Bloking solution室温30min，将切片转入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体中孵育室温1h，TBS漂洗5min×3次，NBT／BCIP显色液显色^［7］1～2h(37℃），水性封固剂封片。

阴性对照：1．将切片用RNA酶进行预处理后杂交；2．以不含探针的预杂交液进行杂交；3．以正常羊血清代替羊抗Dig抗体－AP复合物，染色结果均为阴性。

结果

1．RT-PCR

将大鼠下丘脑视前区prothymosin α₁的PCR产物及GAPDH的PCR产物与胸腺prothymosin α₁的PCR产物同时进行电泳，结果在视前区出现与组织阳性对照的胸腺prothymosin α₁(图1B）同样清晰的339bp的谱带(图1C），即预期的prothymosin α₁谱带，说明在大鼠下丘脑视前区有很强的prothymosin α₁-mRNA信号表达。

脑组织RNA阳性对照的GAPDH-PCR检测结果，出现了预期的393bp的谱带(图1D），表明本实验结果不是由于基因组DNA污染所造成的假阳性结果。

把大鼠下丘脑视前区RNA作为样品添加设立的PCR阴性对照检测结果，没有出现任何谱带(图1E）。

图1RT-PCR检测结果

A．DNA分子量标准 B．胸腺组织前胸腺素α₁R T-PCR产物，339bp C．下丘脑视前区前胸腺素α₁RT-PCR产物，339bpD．下丘脑视 前区GAPDH RT-PCR产物，393bpE．PCR阴性对照

Fig.1 Analysis of prothymosinα₁mRNA expression by RT-PCR.

A,DNA markerB,The Prothymosinα₁RT-PCR product of thymus,showing 339bp ban dsC,The prothymosin α₁ RT-PCR product of preoptic area of the hypothalamus, showing 339bp bands D,The GAPDH RT-PCR product of preoptic area of the hypothalamus,showing 393bp bands E,Negative control of PCR reaction

2．原位杂交组织化学染色

用地高辛标记的prothymosin α₁合成寡核苷酸探针对脑组织切片进行原位杂交组织化学染色，结果表明在大鼠下丘脑视前区大细胞核部分神经元有很强的prothymosin α₁-mRNA的表达，阳性神经元的胞质内充满蓝紫色的阳性杂交产物(图2）；在位于同一核团的相邻切片，用地高辛标记的GnRH合成寡核苷酸探针进行原位杂交的结果表明，该核团内的部分神经元表达GnRH-mRNA(图3）。在视前室周核(图4）及视交叉上核(图5）的部<