【摘要】目的观察酪氨酸羟化酶(TH)和胶质细胞系源 性神经营养因子(GDNF)基因工程细胞联合移植到纹状体内对帕金森病(PD)大鼠的治疗作用。 方法重组携带TH基因的质粒表达载体pCMVTH及携带GDNF基 因的质粒表 达载体pCl-neo，分别转染原代培养的成纤维细胞，筛选阳性细胞植入大鼠帕金森病模型纹 状体内，动态观 察行为学变化，并用高效液相色谱于第4、8、12、16、20周测定多巴胺、3，4-二羟苯乙酸 ( DOPAC)及高香草酸(HVA)含量的变化。结果联合移植TH及GD NF转基因 细胞致PD大鼠纹状体内可明显减少模型单侧旋转行为，可降至移植前旋转圈数的44.3±5. 2%(P＜0.01)，其效果优于单独移植TH(65.6±6.1%)或GDNF(64.8±5 .8%)转基因细胞的PD模型(P＜0.05)；显著提高纹状体内多巴胺含量， 恢复至移植前水平的21.4±3.47%(P＜0.001)，其程度高于单独移植TH (12.9±1.4%)或GDNF(14.5±2.2%)转基因细胞的PD模型(P＜0.05)。 结论TH及GDNF联合基因治疗具有潜在的临床应用价值。

【中图分类号】R741.05；Q812【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)-增-32

AN EXPERIMENTAL STUDY ON GENE THERAPY OF PARKINSONS DISEASE WITH TWO GRAFTS OF GENETICALLY ENGINEERED CELLS EXPRESSING TYROSINE HYDROXYLASE AND GLIAL CELL LINE-DERIVED NEUROTROPHIC FACTOR IN THE RAT

ZHANG Jing-zhong,YANG Hui,DUAN De-yi,DUAN Chun-li,SUN Xiao-hong,ZHA O Chun-li,

ZHANG Jin-lu,XU Qun-yuan

(Beijing Institute for Neuroscience,Capital University of Medical S ciences,Beijing 100054,China)

【Abstract】ObjectiveTo observe the improvement of motor ab normalities and striatal levels of dopamine and its metabolites in rat model of Parkinson's disease by combining intracerebral grafts of two kinds of geneticall y modified cells expressing tyrosinehydroxylase and glial cell line-derived n eu rotrophic factor.MethodsThe cultured primary fibrob lasts were sele cted for genetic modification and intracerebral grafting.The recombinant vectors ,pCMVTH containing TH gene and pCI-neo containing GDNF gene,were transferred in t o the fibroblasts in vitro by using lipofectin technique.The cells expressing TH and the cells expressing GDNF were then grafted ipsilaterally into the striatum in PD models rats.The levels of the striatal dopamine(DA), 3,4-dihydroxyphenyl ac etic acid(DOPAC)and homovanillic acid(HVA)in the rat models were determined by u sing high performance liquid chromatography(HPLC).The tests were done in 4, 8, 1 2,16 and 20 weeks after intracerebral transplantation.Results The g rafted genetically modified cells expressing TH and GDNF could substantially red uce the asymmetric rotational behavior of PD rats with a long-term.The scores o f asymmetric rotation of these rats after apomorphine administration decreased to 44.3±5.2%(P＜0.01).The levels dopamine in the striatum decr ease d to 1.92±0.15% and was up to 21.4±3.47%(P＜0.001)compare d wi th its normal level.ConclusionThe combining transp lantation of TH gene-expressed and GDNF gene-expressed cultured fibroblasts is useful with re gard to the treatment of PD and had a potential usage in the clinic.

【Key words】Parkinson disease;Gene therapy;TH;GDNF材料和方法1.TH及GDNF基因工程细胞的构建、筛选与鉴定

质粒pCMVTH的构建、转染及筛选方法参见文献^［6］。用RT-PCR方法从我国自行 建立的BT3 25胶质瘤细胞系中克隆出全长 GDNFcDNA(588bp)，然后插入表达质粒 pCI-neo(Promega)， 酶 切鉴定为正向连接，经Lipofectin 介导转入原代培养的成纤维细胞，根据其携带的neo基因 采用G418筛选转染阳性克隆。采用地高辛标记TH及GDNF探针，原位杂交证实转基因 细胞 内有TH mRNA及GDNF mRNA表达，且免疫细胞组织化学方法在这两种基因工程细胞中可以分别 检测到TH及GDNF免疫反应产物(另文报道)。

2.大鼠PD的建立及检测

用体重180～210g的雌性SD大鼠，麻醉状态下在左侧纹状体内两点注射6-OHDA(3g/L，含0 .02%的维生素C，生理盐水配制)，坐标分别是：A11.0、L12.5、V15.0、A20. 5、L23.0、V2 5.5(齿棒均低于耳间线2.4mm)，每点注射2.5μl。注射6-OHDA后第7 d给大鼠皮下注射溶于生理盐水的阿普吗啡(0.05mg/kg)，以大鼠旋转记录仪^［7］检 测其 旋转行为40min。此旋转测试每周1次，持续4周。旋转圈数大于6圈/min的大鼠视为帕金森病 模型。

3.实验分组及基因工程细胞的脑内移植

将被选中的PD大鼠模型根据移植物的不同分为5组：TH+GDNF组(20只)、GDNF组(15只)、TH组 (15只)、LacZ组(9只)及未行移植术的空白对照组--Lesion组(5只)。各实验组动物脑内移 植 入相应的细胞悬液。细胞悬液中转基因细胞的浓度为1×10⁵/μl。将细胞悬液立体定位注 射(使用50μl的Hamilton注射器和22号针头)到动物模型的左侧纹状体内(两点注射：A11 .8、L12.5、V14.5、A20.6、L22.0、V24.5，齿棒在零点，每点注射7.5 μl)。移植后，所有动物均按前述方法进行旋转试验。

4.疗效观察

4.1行为学观察：细胞移植后每周进行阿普吗啡诱导，观察动物的旋转行为。

4.2脑内DA及其代谢产物含量的测定：分别在4、8、12、16、20周对各实验组的大鼠进 行 断头取脑，在冰浴中迅速解剖出双侧尾状核，做好标记，放入液氮中速冻后贮存于-80℃冰 箱待测。测定前，将冰冻组织室温融化，称重，置入300μl预冷的0.1mol/L高氯酸(内含0 .3mmol/L Na₂EDTA,0.5mol/L Na₂SO₃)中，加入适量内标物DHBA，匀浆，高速离 心(15 000r/min)15 min后，取上清液20μl进样，应用高效液相电化学检测器(HPLC)进行多 巴胺及其代谢产物3、4二羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)检测。色谱条件：流动相为50mm ol/L 乙酸钠枸橼酸缓冲液，pH3.5(内含1.0mmol/L B-8离子对试剂，0.6mmol/L二正丁胺，0 .3 mmol/L Na₂EDTA,2%乙醇)；流速1.0/min；玻璃碳工作电极，Ag/AgCl 参比电及检测电压 为+0.75V；DHBA为内标物，样品中每个组份用内标分析法进行定量。标准品倍比稀释作标 准曲线。

单胺类试剂及其代谢产物的标准品如肾上腺素、去甲肾上腺素、5-羟色胺、5-羟基吲哚乙 酸、3、4二羟基苯胺、DA、DOPAC和HVA均购自Sigma公司。

5.统计学处理

所有数据均以均数±标准误表示。统计方法为小样本均数t检验和多样本均 数方差分析 ，组间比较用Q检验，P值小于0.05者为差异有显著性 意义。

结果

1.行为学观察

1.1各实验组内移植前与移植后旋转行为的比较：结果如图1所示。经t 检验证实，移植后 T H+GDNF组旋转行为明显减轻，下降至44.32%(P＜0.01)，TH组及GDNF组 的旋转圈数也分别降至68.12%(P＜0.05)和65.55%(P ＜0.05)，LacZ组与空白对照组行为学移植前后无明显改变(P＞0.05) (图1)。

1.2各实验组间移植后旋转行为的比较：结果如图2所示。Q 检验表明：(1)LacZ组与 GDNF组及TH+GDNF组的比值在各时间点均有差异显著性意义(P＜0.05)；( 2)TH组的比值在1～6周及第10、15、16周与GDNF组相比较无差异显著性(P＞ 0.05)；(3)TH+GDNF组的比值除在第9周与GDNF组相比无差异显著性(P＞0.05)外，其他各时间点与其他各组 相比均有差异显著性意义(P＜0.05)。

图1各实验组移植后与移植前旋转 行为的比较

Fig.1 Apomorphine-induced mean rotation turns Per minute in PD Rats be fore and after receiv ing implants of genetically modified cells expressing GDNF,TH,GDNF+TH and LacZ,r espectively.

图2各实验组移植后与移植前旋转行为比值的动态比较

Fig.2 The ratio of mean rotation turns per minute in PD rats at differe nt times after receiving implants to before receiving implants of geneticall y modified cells expressing GDNF,TH,GDNF+TH and LacZ,respectively.

2.神经生物化学检测

2.1各实验组脑内DA、DOPAC、HVA术侧与健侧比值的比较：空白对照组术侧DA、DOP AC、HVA含量与健侧之比分别为1.92%、1.56%和5.52%，经t检验证实，与 LacZ组相应指标含 量无统计学意义(P＞0.05)。TH组与GDNF组之间DA、DOPAC、HVA含量无统 计学意义(P＞0.0