【摘要】目的研究GnRH类似物(阿拉瑞林)诱导胃平滑肌细胞内钙动 员的机制。方法采用共聚焦技术检测细胞内钙荧光强度的变化。 结果(1)在Hanks液中，GnRH类似物浓度为10^-7、10^-6、10 -5mol*L^-1时，胃平滑肌细胞内Ca²⁺逐渐升高，其峰高(peak-restin g)分别为6.00±0.50、9.23±0.62、18.97±2.42，其达峰时间分别为42.37±1.65 、54.93±3.22、105.63±3.92s，并呈时间和剂量依赖性；(2)当阿拉瑞林浓度为10 -4mol*L^-1时，胞内Ca²⁺略有升高，与10^-5mol*L^-1相 比(P＜0.01)；(3)在有外钙和无外钙时，阿拉瑞林对胞内Ca²⁺ 的升高亦有显著 差异(P＜0.01)；(4)在无外钙并加入内罗啶孵育后，GnRH引起的胞内C a²⁺轻度 升高，但与D-Hanks组相比无显著性差异(P＜0.05)；(5)在Hanks液中， 用拉西地平孵育后 ，再加入阿拉瑞林，其胞内Ca²⁺仍可升高，并有显著差异(P＜0.0 1)。结论Ca²⁺参与了GnRH 类似物阿拉瑞林对胃平滑肌细胞作用的细胞内分子 转导过程。细胞内Ca²⁺的增加既源于内钙的释放又源于外钙的内流。

【中图分类号】Q579.2【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)增-112

EFFECTION OF GnRH ANALOGUE ON INTRACELLULAR CALCIUM MOBILIZATION IN CULTURED RAT STOMACH SMOOTH MUSCLE CELLS

HEN Lei，HUANG Wei-quan， L Bao-zhen，PU Ruo-lei

(Department of Histology and Embryology，)

LIU Li-hong

(Department of pharmacolo gy，the Fourth Military Medical University，Xi'an710032，China)

【Abstract】ObjedctiveTo study the mechanism of GnRH agal ogus( Alarelin)on［Ca²⁺］_i mobilization in stomach smooth muscle cells (SSMC)o f rats.Methods Cells were cutured and loaded with Fluo -3-AM.［Ca²⁺］_i was measured by fluorescent intensity(FL)in each cell with confocal microscopy.Results (1)In Hanks solution，10 ^{- 7}，10^-6，10 ^-5mol*L^-1Alarelin can elevate［Ca²⁺］_i ， its peak-resting values reached 6.00±0.50、9.23±0.62、18.97±2.42 respec tively，which indicate that the level of ［Ca²⁺］_i act in an dose-depen de nt and time-dependent.(2) Contrarily，when Alarelin was 10^-4mol*L^-1 ， its peak-resting value only reached 6.32±0.67， conpared with Alarelin 10 ^-5mol*L^-1，which was sigificantly lower(P＜0.01.(3)［ Ca²⁺］_i wa s also singificantly higher in Hanks solution than that in D-Hanks solution(P＜ 0.05).(4)In D-Hanks solution with ryanodine，Alarelin had no effect on levels of ［Ca²⁺］_i，compared with group of D-Hanks(P＞0.05).( 5)When pertreatment with Lacidipine in Hanks solution，the effect of Alarelin 10^-5mol*L -1 was partly inhibited(P＜0.01)。Conclusion The data indicate that［Ca²⁺］_i plays an important role in molecular mechanism of intrace llular singal transduction pathways which GnRH analogue，Alarelin mediate in SSM C .T he increasing of［Ca²⁺］_i was caused by releasing from intracellular sto r es and extracellular Ca²⁺influx，possibly through L-type calcium channels .

【Key words】GnRH analogue; Stomach smooth muscle cell; Ca 2+; Flue-3-AM; Confocal microscopy现已知，促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)受体，广泛存在于下丘脑-垂体轴之外的组织中，例如性腺的颗粒细胞、胎盘滋养层细胞及子宫平滑肌细胞中均发现有GnRH受体的存在^［1，2］。我们先前的实验也已证实大鼠消化系统广泛存在有GnRH受体的阳性细胞^［3］。但对于具体功能尚未阐明，本实验采用荧光探针Fluo-3-AM标记培养大鼠胃平滑肌细胞内的游离［Ca²⁺］_i，通过共聚焦显微镜观察单个细胞内荧光强度的瞬时变化，探讨GnRH类似物对胃平滑肌细胞作用的分子转导机制。

材料和方法

1.试剂

阿拉瑞林(alarelin)购自上海丽珠东风生物技术有限公司、拉西地平(lacidipine)由本校药理教研室合成，经核磁共振氢谱确证其结构，HPLC纯度分析大于98%，使用时以二甲亚砜(DMSO)：15%吐温-80(1：50)配制。胶原酶、荧光探针Fluo-3-AM、依他酸(EGTA)、内罗啶(ryanodine)均购自Sigma公司。胰蛋白酶购自华美公司 。Hanks液含(mmol·L^-1CaCl₂ 1.3，KCl 5.4，KH₂PO₄ 0.4，MgCl₂·6H₂O 0.4，MgSO₄·7H₂O 0.4，NaCl 137，glucose5.6)D-Hanks液含(mmol·L^-1KCl 5.4，KH₂PO₄0.4，MgCl₂·6H₂O 0.4，MgSO₄·7H₂O 0.4，NaCl 137，EGTA0.1)。

2.大鼠平滑肌细胞(stomach smooth muscle cell，SSMC)的培养

根据参与文献［4］介绍的方法并稍作修改。选用1～3d的雄性SD大鼠，75%酒精消毒腹部后，暴露腹腔。剪取胃部，立即置冰冷的Hanks液中，仔细刮除食物残渣及内膜，留下肌层和外膜，用冰冷的Hanks液冲洗3～4次。用剪刀剪碎后，置于一定量的1g·L^-1胶原酶中，放置37℃搅拌消化60min，每20min收集1次细胞，离心中止消化，以DMEM培养液(含100mg·L^-1小牛血清)制备成细胞悬液，并调整细胞密度为1×10⁶/ml。种植入培养瓶中，置37℃，50ml·L^-1CO₂培养箱中孵育，贴壁90min后，将细胞悬液移入另一培养瓶，以后每3d换液1次。至平滑肌细胞长满成单层，此时细胞呈典型的“峰谷”状排列。免疫组织化学显示，培养细胞为α-actin反应阳性，证实为平滑肌细胞。以250mg·L^-1胰酶消化传代。将3～5代细胞接种于一种特制的50mm培养皿中培养皿(下底部中央有一直径1mm小孔，从下方粘贴1个盖玻片)，培养24h细胞贴壁生长，荧光标记检测细胞内Ca²⁺水平。

3.荧光探针Fluo-3-AM标记细胞内Ca²⁺

以二甲亚砜将Fluo-3-AM配成1.0mmol·L^-1储备液低温冻存，用时以pH7.4 D-Hank液稀释成10μmol·L^-1应用液，将各处理细胞以D-Hank液冲洗3次，加入0.2ml10μmol·L^-1Fluo-3-AM，避光置37℃30min，吸出染液，以Hank液洗3次，加入0.2ml Hank液后用于检测。

4.实验分组及检测方法

(1)Hank液组：将阿拉瑞林分4个浓度梯度，分别为10^-4、10^-5、10^-6、10^-7mol·L^-1；(2)D-Hank液组：用阿拉瑞林10^-5mol·L^-1；(3)内罗啶组：用10μmol·L^-1孵育10min后加入D-Hank液+10^-5mol·L^-1的阿拉瑞林；(4)拉西地平组：用拉西地平10μmol·L^-1孵育10min后加入Hank液，然后再加入10^-5mol·L^-1阿拉瑞林进行检测，具体方法是将培养皿置于ACAS570载物台上，在激光共聚焦显微镜下动态扫描细胞内荧光强度变化，激发波长488nm，发射波长522nm，采样频率为488Hz，共聚焦系统由Bio-Rad公司提供的软件控制，在Penftium90计算机中运行，每皿选2～3个视野，以平均荧光强度变化反映胞内游离钙浓度的相对水平。

5.数据分析

数据经Pentium 90微机系统对图形及时间进行实时测量而获得。以均数±标准差(±s)表示，采用SPLM软件进行单因素方差分析。

结果

1.阿拉瑞林对胞内Ca²⁺的影响

将上述分别Fluo-3-AM标记的胃平滑肌细胞置ACAS570上观察，可见经标记的细胞，其中部荧光强度较强，周边较弱。由于细胞状态的不同，基础荧光强度不同(以荧光强度表示)。阿拉瑞林可引起胞将内Ca²⁺的迅速升高。当阿拉瑞林为10^-7、10^-6、10^-5mol·L^-1时，其峰高值分别为6.00±0.50、9.23±0.62、18.97±2.42，(F＝97.81，P＜0.01)其达峰时间依次为42.97±1.65、54.93±3.22、105.63±3.92s，(方差分析F＝498.42，P＜0.01)，可以看出有明显的时间和剂量依赖性。当阿拉瑞林浓度为10^-4mol·L^-1时，其峰高为6.32±0.67，达峰时间为77.47±1.55s，无时间和剂量依赖性。

附表10^-5mol·L^-1对培养的胃平滑肌细胞［Ca²⁺］_i的影响