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【中图分类号】R971.2【文献标识码】A 【文章编号】0592-1356(2000)-增-57
c-fos ANTISENSE OLIGODEOXYNUCLEOTIDE REDUCES BE E VENOM-INDUCED PPTA mRNA EXPRESSION IN THE NEURONS OF SPINAL DORSAL HORN
WANG Wen， WU Sheng-xi， WANG Ya-yun，NI Tong-shang，ZHU Min，LI Yun -qing*
(Department of Anatomy and K.K.Leiung Brain Research Centre，the Fourth Military Medical University， Xi＇an 710032，China)
【Abstract】Objective To investigate the roles of Fos protei n in the regulation of prepro tachykinin A (PPTA)gene expression.Metho d s Intraplantar injection of bee venom (BV) was used as a pain model.Immu n ohistchemistry and in situ hybridization were performed to obser ve the effects of intrathecal pretreatment of c-fos antisense oligodeoxynucleotid e (ASO) to the expr ession of Fos protein and PPTA mRNA expression in the spinal dorsal horn.Results Administration of BV into the plantar surface produced a ton i c， monophasic nociceptive response，induced Fos expression in the neurons of th e ipsilateral spinal dorsal horn and increased the number of PPTA mRNA Positive ne urons.Intrathecal pretreatment with c-fos ASO not only significantl y inhibited t he BV-induced nociceptive response but also reduced the number of Fos and PPTA mRNA positive neurons in the spinal dorsal horn.Conclusions F os might play important roles in the processing of noxious information and take pa rt in the noxious stimulation-induced upregulation of PPTA mRNA expression in t he neurons of spinal dorsal horn.
【Key words】c-fos;Preprotachykinin A；Antisense oligodeoxyn ucleotide;Nociception;Spinal cord;in situ hybridization histochimist ry;RatP物质(SP)是外周的致痛物质之一，在伤害性信息的传递过程中起着重要 的作用。前速激肽 原A (PPTA)是SP的前体。以往的研究观察到皮下注射福尔马林、角叉菜胶、完全弗氏佐剂等 多种伤害性刺激均可引起脊髓背角浅层神经元表达PPTA mRNA 的水平上调［1，2］ ，提示存在外周伤害性刺激对脊髓背角浅层神经元的跨突触激活机制。但是参与背角神经元 内PPTA mRNA 表达调节的因素尚不清楚。我们的研究观察到外周伤害性刺激条件下，刺激 侧脊髓背角内PPTA mRNA 阳性神经元同时表达Fos蛋白［3］，提示作为转录因子的F os 蛋白可能也参与PPTA基因的转录调节。为进一步验证此推测，本研究利用反义寡核苷酸(ASO )技术结合形态学方法，在足底注射蜜蜂毒(BV)致痛的大鼠模型上观察了椎管内给予c-fos ASO对PPTA mRNA 在大鼠脊髓背角神经元表达的影响。
材料和方法
1.实验动物
健康成年雄性SD大鼠22只，体重180～220g，每只动物单独饲养于塑料盒(22～26℃)中。为 了保持其生物节律，实验室每日晨8：00至20：00开灯，20：00至次日8：00熄灯，行为学实 验均在9：00～18：30间进行。实验前5d每日将大鼠置于实验观察箱中 30 min，使之适应。 大鼠随机分组，第1组(n=11)用于行为学和免疫组织化学检测；第2组(n=11)用于行为学和原位杂交组织化学检测。
2.反义寡核苷酸和鞘内置管术
c-fos寡核苷酸由上海 Sangon 公司合成，全碱基硫代磷酸修饰。反义寡核 苷酸(ASO)和正义 寡核苷酸(SO)的序列分别为：5’-GAA CAT CAT GGT CGT-3’和5’-ACG ACC ATG ATG TT C-3’。
大鼠经氯氨酮50～100 mg/kg麻醉后，从背侧C7水平沿中线向尾侧切开并去除下胸椎椎板 ， 剪开硬脊膜，经蛛网膜下腔向尾侧置入聚乙烯PE-10导管(日本Natume公司)至腰膨大(L 4～ L5)。然后经导管外口注入50μl无菌生理盐水，见硬脊膜破口处有气泡及脑脊液溢出，即 封外口。外露部分固定于皮肤。术后3d，选择状态良好、无活动障碍的动物进行实验。实验 完毕后解剖动物，以确定鞘内导管的位置。
3.BV注射、鞘内给药及行为学观察
用1 ml注射器快速将BV(4g/L)注射入大鼠一侧后肢足底中心皮下。在给予BV前4h，分别鞘 内注射生理盐水(10μ1，n=6)、c-fos SO (50μg/10μl，n=8)和 c-fos ASO (50μg/10μl，n=8)。推进速度为0.5μ1/s。
将30cm×30cm×30cm的透明有机玻璃箱置于高于实验台50 cm的架子上，实验前动物均在实 验 箱中适应30 min以上。大鼠一侧后肢足底中心皮下注入BV后立即将其放回实验箱开始检测， 记录自BV注射起1h内每5min 的自发缩足反射次数。
4.免疫组织化学染色及原位杂交步骤
第一组大鼠(n=11)在BV注射2h后，以戊巴比妥钠(40mg/kg，i.p)麻醉，常规 灌注取材。取腰 段(L4～L5)脊髓置上述固定液中后固定4h(4℃)，再移入含30%蔗糖的0.1 mol/L PB中 过夜(4℃)。冠状冰冻切片(厚30μm)。隔2张取1片，共分3套收集。第1套切片经0.01 mol /L PBS清洗后，用兔抗Fos血清(1：1 000，中山公司) 室温孵育过夜；ABC 法呈色，光镜观 察并摄片。用正常羊血清代替一抗孵育第2套切片，结果呈阴性。第3套切片进行Nissl染色 ，以确定脊髓灰质分层。
第2组大鼠(n=11)在蜜蜂毒注射20h后，用戊巴比妥钠(40 mg/kg，i.p)麻醉 。断头后快速取腰 段(L4～L5)脊髓，立即包埋于干冰粉末中。恒冷箱切片(厚14μm)。切片贴于经明胶处 理的载玻片上，置 -70℃冰箱中保存备用。实验所用PPTA探针为寡核苷酸探针，含30个碱 基，其序列与大鼠脑内相应mRNA的一部分(175～204号碱基)互补［4］。探针用3’末 端标 记法及［α-35S］dATP(＞1 000 Ci/mmol，Amersham)标记。标记探针的特异放 射活性 为1.2×109dpm/μg。切片快速干燥后依次用4%多聚甲醛、0.1 mol/L PB及杂交 前处理液(含0.9%氯化钠、1.5%三乙醇胺和0.25%乙酸酐)处理。杂交时将200μl杂交液［ 含4×SSC、50%甲 酰胺 、0.025%tRNA、10%硫酸苏糖、1×Denhardt液(含0.02%牛血清蛋白、0.02% Ficol 400、0.02% PVP K-30)］，15μl DTT及标记探针(6～9×106dpm/载玻片)滴于切片表面 ， 置湿盒中于40℃孵育48h。杂交后，用1×SSC冲洗(55℃，3×20min)，最后将LM-l型乳胶(A m ersham)涂于切片表面，暗盒中曝光(4℃)。4周后，用Kodak D-19显影液显影，F-5坚膜定 影液定影，1%硫堇复染。脱水、透明、封片，光镜下明、暗视野观察并摄片。
每只大鼠均选取6张切片分别进行Fos及PPTA mRNA阳性细胞的计数。行为学测定及细胞计数 的数据均为±s表示，应用ANOVA检验作统计学分 析，P＜0.05时具有显著性统计学意义。
结果
1.行为学检测结果
足底皮下注入BV可诱致持续、单向性痛行为反应(包括缩足反射和抬足/舔足行为)，且持续1 ～2h以上。鞘内预先注入等体积的盐水、SO和ASO后，BV诱导的每5 min平均缩足次数见图1 。A SO处理使BV诱导的缩足反应显著降低(P＜0.01)，与盐水组相比降低了54. 2%。SO处理使缩足反射轻度降低，但无统计学差异(P＞0.05)。
图1c-fos ASO、SO或生理盐水组足底注 射BV后大鼠1h内每5min平均缩足次数。**与SO组及盐水组比较，P＜0.01
Fig.1 Column graph showing the average flinches per 5 min during 1h observation period after BV injection with pretreatment of c-fos ASO，SO or sa li ne.**P＜0.01，compared with SO group and saline group.
2.免疫组织化学染色结果
足底皮下注射BV 2h后，在注射侧L4～L5脊髓背角观察到大量Fos阳性神经元。阳性神 经 元主要位于背角浅层(Ⅰ、Ⅱ层)，在Ⅲ～Ⅴ层也有散在分布。椎管内预先给予盐水、SO和AS O后，背角浅层Fos阳性神经元的数量见附表。与盐水组和SO组相比，c-fos ASO使背角浅层Fos阳性神经元的数量明显减少(图2)。
附表鞘内注射盐水、c-fos SO和ASO对BV 诱导的脊髓背角浅层Fos和PPTA mRNA表达的影响((
