【摘要】目的为揭示海人酸癫痫模型海马内神经元的死亡机制。方法选用海人酸诱导的癫痫大鼠模型，对海马内凋亡神经元的超微结构进行观察。结果电镜下，实验组大鼠海马齿状回门区和CA1区内可见散在的凋亡神经元，凋亡神经元主要表现为核周染色体的聚集和凝结成块，其核膜表现为皱缩和扭曲，在晚期凋亡的神经元有时可见核膜破裂。凋亡神经元胞浆内的细胞器保持完整。结论凋亡参与了海人酸诱发癫痫发作后海马内神经元的死亡过程。

ULTRASTRUCTURAL STUDY OF APOPTOTIC CELLS IN THE

HIPPOCAMPUS OF RAT AFTER SEIZURES

Sui Hongjin, Gong Jin, Li Dongdong^*,Zhang Wanqin^*△,Hong Jaushyong^**

(Department of Anatomy; *Department of Physiology, Dalian Medical University, Dalian;

**National Institute of Enviromental Health Sciences.USA)

【Abstract】Objective To investigate the dying mechanism of hippocampal neurons in kanic acid (KA) in-duced seizures.MethodThe ultrastructures of apoptotic cells in the hippocampus of rat after KA induced seizures were studied.Results Apoptotic cells were found among normal dentate hilus cells and CA1 cells. Chromatin condensation and clumping could be seen in the apoptotic nuclei. The shrinkage of the nucleus was shown by foldings and whorls of the nuclear membrane. At late stage of apoptosis, the nuclear membranes could be broken. The cell organellae were often kept normal in apoptotic cells.Conclusion The results of this study show that apoptosis takes part in the neuronal dying process in KA induced seizures.

【Key words】 Epilepsy; Kanic acid; apoptosis; Hippocampus; Rat

颞叶癫痫是最常见的神经系统疾病之一。其特征是由于脑细胞的突然过度放电所引起的反复性发作，伴随不同的临床和脑电图表现^［1］。海人酸(KA)是脑内兴奋性氨基酸递质——谷氨酸的结构类似物。脑内或系统给予惊厥剂量的海人酸，可选择性的激活边缘系统，引起急性癫痫发作。目前，海人酸模型已广泛用于癫痫发作的研究。其特点是具有与人类颞叶癫痫极为相似的癫痫发作行为特征和海马硬化的神经病理学改变^［2］，其中包括海马齿状回门区神经元和CA1／CA3区神经元缺失^［3～5］。

凋亡是一种细胞程序性死亡的方式，是由于在某种条件下细胞内某些相关基因被启动，从而引发的细胞主动性死亡的过程。在生化方面，凋亡细胞的特点主要表现为染色体断裂，DNA降解，片段化；而在形态学方面，凋亡细胞的特点则主要表现为染色质浓缩、边集，并伴有细胞皱缩^［6］。

Qin等^［7］学者认为，程序性死亡可能参与了兴奋性毒素所引起的细胞死亡的过程，兴奋NMDA受体可以诱发脑内神经元凋亡。为了进一步揭示海人酸癫痫模型海马内神经元的死亡机制，本研究在电镜水平对癫痫发作后大鼠海马内凋亡神经元的超微结构进行了观察。

材料和方法

1.动物处理

雄性SD大鼠24只，体重180～250g,分为实验组(n=16)和对照组(n=8)。实验组大鼠颈部皮下注射KA(10mg/kg;5g/L)，对照组大鼠颈部皮下注射生理盐水(2ml/kg)。根据Racine^［8］所描述的癫痫行为1～5级标准，观察实验组动物全部达到4级或5级后，即认为实验组动物已符合癫痫模型的要求。

对照组和实验组动物分别在给予生理盐水或KA1、3、5、7d后以水合氯醛(400mg/kg)麻醉。经心脏先以100ml生理盐水冲洗后，再用含2%多聚甲醛1.25%戊二醛的0.1mol/L的磷酸缓冲液200ml灌流固定。取脑，用与灌流液相同的固定液后固定过夜，再将其浸泡于含20%蔗糖的磷酸缓冲液中直至下沉。

2.光镜及电镜样品制备

沿大脑正中裂将鼠脑分为左、右两部分。取左侧脑组织常规脱水，石蜡包埋。石蜡切片机切取脑片，脑片厚度为10μm,硫瑾染色，光镜下观察。

取右侧脑组织用振动切片机切片，片厚为60μm。2%锇酸(pH7.4)室温下后固定1h，磷酸缓冲液洗3次，梯度酒精脱水，Epon812平板定位包埋。光学显微镜下分别选取齿状回门区和CA1区的组织，并将其粘在预制的空白包埋块上，LKB超薄切片机切片，经醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，JEM-2000EX透射电镜观察并摄片。

结果

1.光镜结果

海马齿状回门区(图1)KA后1d，仅偶见凋亡神经元；KA后3d，可见较多的凋亡细胞；KA后5d凋亡细胞数目最多；KA后7d，该区凋亡神经元的数目已开始减少。

海马CA1区(图2)KA后1d，仅偶见凋亡神经元；KA后3、5d，凋亡神经元的数目渐次增多；KA后7d，凋亡神经元的数目达到最多，同时伴有神经元数量的明显减少。

海马齿状回门区和CA1区凋亡神经元的形态表现为胞核、胞质深染，整个神经元呈浓缩状态，体积缩小，细胞突起明显减少，甚至消失。

2.电镜结果

电镜下，KA后3、5、7d时，在海马齿状回门区和CA1区均可见到不同阶段的具有凋亡表现的神经元，其凋亡表现与注射KA的时间不同步。在齿状回门区和CA1区所见凋亡神经元的形态大致相同，许多凋亡神经元周围可见胶质细胞突起包绕。早期阶段的凋亡神经元的形态仅表现为染色质积聚成块、边集(图3)。而且经常可见集聚的染色质在核内形成不规则的染色质环，环内为电子密度低的核质及均匀分布于核质内的细小的颗粒状物(图4A)。在凋亡的晚期阶段，有时全部染色质完全聚集在一起，在核内形成一个大的高电子致密度的染色质团块。凋亡神经元的核膜常会出现皱缩、折迭和扭曲(图5A)。在凋亡的晚期阶段，核膜常出现破裂。

在凋亡的早期阶段，胞浆内的变化仅表现为部分粗面内质网略有肿胀(图3)。此时，胞浆的电子致密度较高，而多数线粒体、高尔基器等其他细胞器仍保持正常状态。在凋亡的晚期阶段，大部分的粗面内质网都出现肿胀，粗面内质网上的核糖体脱落，散在分布于胞质中。

在部分凋亡的神经元胞体内，有时可见一些成束状的微丝样结构(图4B)。这些“微丝束”既可见于胞浆内的细胞器之间，又可见于核内边集的成块的染色质之间。此外，在凋亡神经元的胞体或突起与其邻近结构之间，有时可见到一些突触样结构(图5B)。

讨论

海马是癫痫相关脑区之一。在人类颞叶癫痫患者^［15］以及电点燃或化学点燃^{［10，11］}、局部或系统给予KA^{［4，5，12～14］}等多种癫痫模型中，均会出现海马齿状回门区神经元和CA1区锥体细胞的不同程度的减少。研究证明，KA作为脑内兴奋性氨基酸递质——谷氨酸的结构类似物，在脑内可以作用于谷氨酸或门冬氨酸能末梢的突触前膜上的KA受体，刺激内源性兴奋性氨基酸的释放并抑制其再摄取^{［2，4，15］}，通过其兴奋性神经毒性作用而引发脑内神经元的损伤。KA的兴奋性毒性作用所引发的神经元的损伤很可能是癫痫敏感性长期增强以及动物长期反复发作的形态学基础^［1，2］。尽管如此，迄今为止人们对于癫痫发作后脑内神经元死亡的细胞内机制尚不清楚。Qin等^［7］发现，刺激NMDA受体可以诱发脑内神经元凋亡，提示凋亡或称为程序性死亡可能参与兴奋性毒素引起的细胞死亡的病理过程。我们在海人酸诱导的癫痫大鼠海马齿状回门区和CA1区内发现了凋亡神经元，所见的凋亡神经元的超微结构，主要表现为不同程度的染色质聚集成块和边集以及细胞核皱缩，有时还可见到凋亡小体，这一结果与已往一些学者对脑内凋亡神经元的研究结果相一致^［11］。部分凋亡神经元虽然根据其形态特点难以将其与胶质细胞相区分，但由于在其胞体或突起上可见残存的与邻近结构形成的突触样结构，我们可以确定其为神经元。本研究结果在电镜水平证明，凋亡参与了KA诱发癫痫发作后海马内神经元的死亡过程。

我们在部分凋亡神经元胞体内，有时可见到一些成束状的微丝样结构。对于这些微丝样结构形成的原因以及在凋亡过程中是否具有某种作用尚不明确，需要进一步的探讨。

图版说